Оценка мембранных фильтров для микробиологических анализов Используется
1- Цель
1-1 Настоящий международный стандарт устанавливает способа оценки и сопоставления при водоисследовании
мембранные фильтры для подсчета специфических конкретных и смешанных организмов
микробных популяций.
1-2 Способ обеспечивает общее руководство по сравнительной проверки роста бактерий,
дрожжей и других грибов на мембранных фильтрах, по сравнению с ростом на чашках Петри путем заливки и мазков- разтираний.
Методы заливки чашек
1-3 Этот метод применим к пользовательской оценки любого микропористого фильтра предназначенного для использования исследования
водных образцов. Его диапазон охватывает любой размер пор фильтра, который может быть полезным в конкретных применениях их
1-4 Для конкретного применения, ожидается, что будут использоваться подходящие носители, температура инкубации,
продолжительность инкубации, атмосфера инкубации и методы (растирания или заливка чашек Петри).
Результаты, полученные от одного специфического вида или группы микроорганизмов не может быть действительным для других
2- Определения
Для целей настоящего международного стандарта, применяются следующие определения:
Мембранный фильтр: Тонкая неволоконная фильтрующая среда для жидкостей и газов, средний
размер пор больше, чем 0,01 Ѕm в диаметре, на котором частицы большие чем номинальный размер пор задерживаются на его фильтрующей поверхности или вблизи ее, когда применяется всасывание под давлением
3Принцип
3-1 Фильтрация водных, или чистых культур в жидкой суспензии через мембранные фильтры, используя стандартные методики. Пять повторов - минимальные требования к выборке; в общей сложности 200
колоний считаются минимальным количеством для статистического сравнения.
3-2 Оценка эффективности каждого вида мембранного фильтра по:
а) подсчитывает полученные на неселективной среде путем посева методом заливки или мазков
Посев путем мембранной фильтрации рассчитывают на той же среде (опыт показывает, что при этих
условиях считается лучшим мембранный фильтр который имеет от 80 до 90% от тех, которые получают посевом на чашках);
б) результаты, полученные методом мембранной фильтрации на селективной среде для конкретных организмов с помощью мембранных фильтров или используя метод мазков или заливки чашек
Методы заливки чашек сравниваются с мембранной фильтрацией на той же самой среде.
ПРИМЕЧАНИЯ - контроль методом заливки чашек может обеспечить меньше колоний, чем контроль методом мазков на чашках.
4- Разбавитель, питательные среды и реагенты
4-1 Основной материал
Для того, чтобы улучшить воспроизводимость результатов, рекомендуется, чтобы, по подготовке
разбавителей и питательных сред, использовались обезвоженные основные компоненты или обезвоженные среды.
. Необходимо строго следовать инструкциям изготовителя.
Химические продукты, используемые для приготовления питательных сред и реактивов должны быть
признанны аналитического качества.
Вода должна использоваться деионизированная или дистиллированная вода, свободная от веществ, которые могут ингибировать
рост микроорганизмов в условиях испытания.
Измерения рН проводят с использованием рН-метра, измерения проводятся при комнатной температуре.
Если приготовленные среды не используются немедленно они должны храниться, если нет других установок, при температуре 4Ђ2ЊС в темноте не более месяца, при условиях, которые не оказывают никаких изменений на их состав.
4-2 Разбавитель
Может быть использован любой приемлемой стерильный разбавитель. . Использование пептонной воды [0,1 % m/m ) может подходить для этого.
Это сводит к минимуму шок для организмов обитающих в чистой воде.
4-3 Агаризированая среда
4-3-1 Неселективная среда
Триптон соевый агар или аналогичный носитель может быть использован в качестве неселективной среды для этого теста.
Подготовьте среду и разлейте отмеренное количество среды в чашки Петри (в случае использования метода мембранных фильтров и метода мазков)
или в подходящие пробирки (в случае заливки чашек).
Глубина агара в чашках Петри должны быть не менее 3 мм. Все среды, используемые для каждого теста, должны быть из одной партии и приготовлены одновременно.
4-3-2 Селективная среда.
Используемые питательные среды
должны быть подходящими для использования для чистых культур либо для смешанных культур.
Подготовьте среду и разлейте измеренное количество среды в чашки Петри (в случае использования метода мембранных фильтров и метода мазков)
или в подходящие пробирки (в случае заливки чашек).
Глубина агара в чашках Петри должны быть не менее 3 мм. Все среды используемые для каждого теста должны быть из одной партии и приготовлены одновременно.
5 Аппаратура и посуда
Очистите тщательно посуду и оборудование для фильтрации, с использованием подходящего моющего средства в горячей воде,
6-1- Будь то природная вода, образцы сточных вод, или чистые культуры, которые используются в оценке мембран, они должны быть проанализированы перед испытанием, чтобы получить разбавления,
которые будут использоваться
-
(82-1). На всех этапах тщательно перемешивайте образцы или культуры (5-2), чтобы получить однородное
распределение.
6-2 Находятся ли чистые культуры в стрессовых или не в стрессовых состояниях необходимо установить концентрацию тестовых культур на подходящей среде, чтобы убедится, что используется правильный фактор разведения и получить подходящий диапазон
подсчета (8-2-1).
6-3 Образцы, которые
используется для установления правильных разведений и подсчета диапазонов могут быть использованы в официальном
тесте, если их охладить сразу после испытания в холодильнике, и если они не предназначены для чрезмерно длительного хранения (максимум 48 часов).
Тщательно перемешайте образцы для получения максимальной однородности.
7-
Мембранные фильтры.
Мембранные фильтры должны быть стерильными.
8 Процедура
8-1 Посев и инкубация
До проведения испытания, асептически просушите чашки Петри, содержащие питательный неселективный агар (4-3-1) или специфический агар для тест-организма (4-3-2), в соответствии с одним из
следующих методов:
а) Закрытые крышками, хранить перевернутые чашки Петри в темноте, если среда является светочувствительной, при 25-
30®С в течение от 15 до 17 часов
б) закрытые крышками, хранить перевернутые чашки Петри в темноте при 45 до 50 ®С в течение от 2 до 3 часов.
в) с удалёнными крышками, поместите чашки Петри в ламинарный шкаф под поток отфильтрованного воздуха при комнатной
температуре в течение 1 часа. Если эта процедура выбрана, необходимо провести контроль стерильности.
Культуры для тестирования (раздел 6) должны быть готовы для проведения испытания без промедления. Те же культуры, должны использоваться для посева в различных средах. Равные объемы, между 0,1 мл до 0,5 мл соответствующего разведения культур, должны быть использованы для посева на контрольных чашках, или фильтрации через
мембраны. Объем 0,5 мл не должна быть превышена, как это требует техника мазков на чашках.
Чтобы избежать смещения теста, посев мазками на чашках должен быть выполнен совместно с тестом мембранной фильтрации альтернативно,
используя те же селективные среды или питательное вещество в качестве испытания на мембранных фильтрах.
Если более чем одна партия мембранных фильтров сравнивается, мембраны должны
чередоваться с техникой мазков или заливок в чашки, пока требуемое количество повторов не будет
сделано с конкретной специфической культурой.
Среды с мембранными фильтрами и без них инкубируют после посева при температуре и при соответствующем времени, которые необходимы для изучаемых культур
8-1-1 Мембранный фильтр культуры
8-1-1-1 Стерильным пинцетом (5-3), в асептических условиях снимите мембранный фильтр, который следует протестировать, и поместите в центр, сеткой или лицевой стороной вверх на основание фильтровального аппарата (см раздел 7), затем установите на основание фильтровальную воронку и закрепите ее специальными держателями как это предусмотрено.
Подключите колбу для приемки фильтрата к источнику вакуума (5-1).
8-1-1-2 С отключенным вакуумом, добавить от 20 до 30 мл стерильной воды разбавления (4-2). (5-
10)и такой же объем из того же хорошо перемешанной разбавленного образца, который был использован в методе мазков на чашках, к
(8-1-1 это) воде для разбавления в воронке. Включить вакуум и фильтровать все
Содержимое воронки. Ополосните воронку с 20 до 30 мл стерильной воды разбавления два раза, не отключая вакуум.
Выключите вакуум сразу после последнего полоскания, когда вода прошла через фильтр.
Убрать воронку фильтровального аппарата и снять фильтр стерильным пинцетом с основания фильтровального аппарата.
-8-1-1-3 Поместите тестируемый мембранный фильтр на неселективную или селективную среды (4-3-1) (4-3-2), в зависимости от очередности, убедившись, что под него не попали пузырьки воздуха. Заметив пузырьки воздуха, поднимите фильтр и поместите так, чтобы убрать пузырьки воздуха.
8-1-1-4 Все чашки должно быть инкубированы (5-4) при той температуре и времени, которая соответствует условиям изучения организмов
. 8-1-2 Метод мазков на чашках
8-1-2-1 Набрать от 0,1мл и до 0,5 мл соответствующего разведения культуры, и соблюдая стерильность перенести его на поверхность питательного агара. [Используя стеклянный шпатель(5-8), который был
смочен в этаноле и обожжен] размазать ее по
предварительно высушенной поверхности неселективного питательного агара, либо селективного агара применяющийся для мембранной фильтрации. Чтобы помочь более
равномерному распределению инокулята, чашки можно положить на поворотном столе (5-8).
Закрыть вновь чашки Петри
Крышками, и дать инокуляту возможность полностью поглотиться поверхностью, прежде чем чашки перевернуть.
8-1-2-1 Все чашки должны быть инкубировали (5-4), сразу, как только влага впитается, при соответствующих температурных и временных условиях, необходимых для изучения искомых организмов.
8-1-3 Контроль с помощью метода заливки чашек.
8-1-3-1 Перенести в асептических условиях (5-10) тот же объем из того же хорошо смешанного разведения образцов,
который был использован в процедурах мембранной фильтрации, (8-1-2-1) в стерильную чашку Петри.
(5-9). Затем добавить одну стандартную порцию растопленного агара; (45 ® C), либо неселективный питательный агар
(4-3-1) или селективный агар для мембранного фильтра (4-3-2) и тщательно перемешать два раствора туда и назад,
круговым движением чашки.
8-1-3-2 Оставить агар для тщательного затвердения, затем перевернуть чашку и инкубировать (5-4) соответствующего время,
при требуемой температуре.
8-1-3-3 Для стерильности контролировать несколько пробирок расплавленного агара, использованного для подготовки чашек.
8-2 Интерпретация
8-2-1 Мембранный фильтр с выросшей культурой.
Используйте устройство подсчета колоний (5-5), чтобы подсчитать все типичные колонии (смешанные или чистые культуры) на
поверхность мембраны. Если более чем одно разбавление культуры было использовано для испытания, нужно выбрать те разбавления, которые содержат от 25 до 100 искомых колоний, и достаточное количество повторов, которые в сумме дают не меньше 200 колоний для обработки.
--
Методы мазков и заливки чашек.
Используйте ту же культуру разведения, как и для метода мембранных фильтров, выбранной для мазков на чашках и заливки чашек, чтобы можно было рассчитать и сравнить рост.
Используйте устройство подсчета колоний, чтобы помочь подсчету (5-6) на всей поверхности и в толще агара
. Следуйте обычным счетным процедурам, установленных в
лаборатории для подсчета.
9 Выражение результатов
9-1 Расчет
Для каждой культуры которые используется для тестирования, рассчитывается среднее арифметическое отсчетов искомых организмов, из пяти или больше повторений для каждой обработки.
Извлечение, R выражается в процентах, для каждой из культур данным в уравнение
R = mm/mc * 100
mm: это среднее от подсчета на мембранных фильтрах;
mc: это среднее значение подсчетов на чашках методом заливки или мазков.
9-1-1 установить процентаж роста сравнительных данных полученных с мембранных фильтров и подсчета с чашек Петри на неселективной среде.
9-1-2 установить процентаж роста, сравнительных данных полученных с мембранных фильтров, и подсчета с чашек Петри на селективной среде.
9-2 Интерпретация результатов
9-2-1 При тестировании партии к партии вариаций в мембранных фильтров производимых одним производителем,
Считаются эквивалентными, если подсчет повторов находится внутри 95% доверительный интервала партии с которой они сравниваются.
95% доверия получен при применении следующей формулы;
а) верхний предел для подсчета, m + 2(-m+1 +1)
б) рассчитывает на нижнем пределе, m-2(-m+1 -1)
Где m представляет собой среднее арифметическое из количества бактерий на партию контроля.
мембранных фильтров
9-2-2 При сравнении подсчета на мембранных фильтрах с подсчетом роста на чашках Петри ( учитывая, что метод мазков дает более высокое число колоний, и поэтому этот метод рекомендуется), мембраны на которых подсчет дает 80% или более от контрольного подсчета на чашках, этот результат будет считаться приемлемым. Если мембранный фильтр используется только для подсчета специфических организмов, тогда используются данные полученные на селективной среде.
9-2-3 Рассматривать конкретную марку или тип мембраны лучшей, если она дает средний подсчет колоний на 20% превышающий подсчет на других мембранах.
10 Отчет Тест
Протокол испытаний должен указать использованный метод, четко описать его использование и полученные результаты, с четким указанием способа использования. В нем должно также быть отмечены оперативные детали, не описанные в данном стандарте, или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробной информацией о любых инцидентах который мог повлиять на результаты
. Протокол испытаний включает в себя всю информацию, необходимую для полной
идентификация мембранных фильтров, культур, сред, и разбавителей, которые использовались в испытаниях.
Оно должен также отметить какие-либо подробности не указано работает в этот международный
Стандарт, или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробной информацией о любых инцидентах который мог повлиять на результаьы
результаты. Протокол испытаний включает в себя всю информацию, необходимую для полной
идентификация мембранных фильтров, культур, сред, и разбавителей, которые использовались.