Волкова О.. Шахламов В.А. Миронов А... Атлас сканирующей электронной микроскопии клеток, тканей и органов

Полную версию атласа с изображениями можно скачать здесь: https://yadi.sk/d/hZ2tpWPHvAitY

Электронная почта: mironaaa@yandex.ru

Оглавление

Рецензенты: 3. В. Куприянов, академик АМН СССР; Н. Н. Боголепов, д-р мед. наук, проф.

Атлас сканирующей электронной микроскопии клеток, тканей и органов./Под. ред. О. В. Волковой, В. А. Шахламова, А. А. Миронова. - М.: Медицина, 1987. - 464 с.: ил.

В атласе представлены результаты изучения клеток, тканей и органов человека и животных под сканирующим электронным микроскопом. Изложены принципы работы микроскопа, основные методические приемы препарирования образцов для исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии. Описание трехмерной организации и рельефа поверхности клеток в культуре ткани, тканевых структур органов сердечнососудистой и лимфососудистой систем кроветворения внутренней секреции, пищеварения, дыхания, выделения, половой системы, а также кожи ее придатков и плаценты увязано с механизмами их функционирования. Атлас содержит оригинальные сканирующие электронные микрофотографии указанных клеточных, тканевых и органных образований.

Книга предназначена для морфологов.

ПРЕДИСЛОВИЕ

Прогресс в любой отрасли науки, в том числе и в морфологии, определяется уровнем развития методологии и способов получения и обработки информации. Если еще сравнительно недавно в морфологических исследованиях преобладал аналитический подход, то в настоящее время все очевиднее становится тенденция к интеграции теоретических разработок и полученных результатов. При этом заметны стремления изучить тот или иной процесс одновременно на различных уровнях организации живой материи - молекулярном, субклеточном, клеточном, тканевом, структурно-функциональных единиц, органном, системном и т. д.

В настоящее время морфологическая наука имеет в своем распоряжении достаточно большой набор методических приемов, позволяющих проводить анализ как на молекулярном, так и на органном и даже системном уровнях. Однако совершенствование методов и повышение разрешающей способности микроскопов (основного орудия труда морфолога) сопровождалось, как правило, уменьшением исследуемых объектов и затруднением возможности изучать их трехмерную организацию.

Не преувеличивая, можно сказать, что новую эпоху в изучении цито- и гистофизиологии открыла сканирующая электронная микроскопия. Ее преимущество перед другими методами исследования заключается в возможности одновременного обзора сравнительно большой поверхности с выявлением топографических особенностей и наблюдением ультратонких деталей организации различных тканевых и клеточных элементов.

Основным достоинством метода сканирующей электронной микроскопии благодаря очень высокой глубине резкости является возможность получения объемных (трехмерных) картин, что позволяет наглядно и конкретно представить себе не только топографическую организацию, но и межклеточные и межтканевые взаимодействия в изучаемом образовании. Диапазон применяемых в морфологии увеличений сканирующего электронного микроскопа чрезвычайно широк: от 2 до 50 тыс. раз и более. Это позволяет на одном объекте решать задачи, связанные с исследованием как субклеточного, так и органного уровня организации живой материи.

В Советском Союзе накоплен ценный материал, получивший обобщение в настоящей работе. Изданные книги Т. П. Евгеньевой (1975), Л. Б. Крымского и соавт. (1976), Ю. А. Ровенского (1979) посвящены частным разделам морфологии. Показ новых результатов о строении клеток, тканей и органов - одна из задач атласа.

Настоящая работа представляет собой итог плодотворной деятельности нескольких творческих коллективов г. Москвы, г. Новосибирска и г. Иванова, но поскольку авторы опирались исключительно на собственный материал, не все разделы изложены одинаково полно. Так, в атласе отсутствуют главы, посвященные органам чувств, нервной системе.

Предлагаемый атлас является оригинальным научным трудом, большая часть фотографий публикуется впервые.

Атлас предваряет глава, посвященная методическим аспектам сканирующей электронной микроскопии. Она, по-существу, является введением в атлас. Вместе с тем эта глава дает наглядное представление о богатейших возможностях метода сканирующей электронной микроскопии, а также о методических ограничениях при его использовании.

Надеемся, что после прочтения этой главы читателю станет понятно, почему большая часть микрофотографий получена с препаратов лабораторных животных. Вместе с тем авторы стремились в той мере, в какой это возможно, представить и человеческий материал.

Во второй главе дана оригинальная классификация рельефных образований клеточной поверхности, которой мы стремились придерживаться в последующих разделах.

Последовательность изложения результатов обусловлена стремлением приблизить материал атласа к материалу учебника "Гистология" под ред. В. Г. Елисеева и соавт. (1983).

Предлагая читателям настоящую книгу, мы заранее благодарим за замечания, которые будут сделаны при ее обсуждении. Авторский коллектив сочтет свой труд оправданным, если атлас будет способствовать дальнейшему внедрению сканирующей электронной микроскопии в отечественную морфологию.

С особым удовлетворением выражаем искреннюю благодарность сотрудникам кафедры гистологии педиатрического факультета II МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова, лабораториям патологии клетки Института морфологии человека АМН СССР, МГУ им. М. В. Ломоносова, Ивановского медицинского института, Института экспериментальной онкологии ВОНЦ АМН СССР, Новосибирского института экспериментальной и клинической медицины, принимавшим участие в подготовке и оформлении отдельных разделов атласа.

ГЛАВА 1. СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

За последнее десятилетие сканирующие электронные микроскопы (СЭМ) заняли прочное место среди исследовательских приборов универсального применения. Исследователи, работающие на современных моделях СЭМ, отмечают такие качества этих приборов, делающие их одними из ценнейших в арсенале физических методов изучения микроструктуры, как большую наглядность, легкую интерпретируемость изображений, высокую разрешающую способность, хорошую информативность сканирующей электронной (СЭ) микроскопии, обусловленную возможностью одновременной регистрации целого ряда вторичных излучений и обработки соответствующих им электрических сигналов. К этому можно добавить относительную простоту приготовления образцов для СЭ микроскопии в сравнении с методами подготовки препаратов для просвечивающей электронной микроскопии.

Неоценимую помощь оказывает СЭМ в морфологических исследованиях биологических объектов. Он позволяет детально изучить форму и взаимное расположение структурных элементов поверхности органов, тканей и отдельных клеток, внутреннюю структуру объектов на сколах и срезах, а также с помощью специальных приставок оценить различия в химическом составе микроучастков поверхности.

Принцип работы и возможности сканирующего электронного микроскопа

В основу СЭМ положен принцип формирования изображений на экране электроннолучевой трубки (ЭЛТ) с помощью развертки, синхронной с разверткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого объекта. При этом яркость каждой точки экрана ЭЛТ соответствует интенсивности одного из вторичных излучений, возникающих при взаимодействии электронного луча с веществом объекта в определенной точке его поверхности. Выбор вида излучения для формирования изображения зависит от задачи исследования, поскольку каждый вид излучения несет свою информацию об объекте.

Электронный луч, формируемый в вакуумной колонне осветительной системой, состоящей из электронной пушки и конденсорных магнитных линз, входит в зону действия отклоняющей системы, заставляющей его периодически отклоняться в двух взаимно перпендикулярных направлениях (см. рис. 1). Отклоняясь под действием пилообразных напряжений, поступающих в отклоняющую систему от генератора развертки, луч "прописывает" на поверхности исследуемого образца растр, состоящий из большого количества параллельных строк, длина которых изменяется в зависимости от требуемого увеличения. Коэффициент увеличения (М) равен отношению длины строки на экране ЭЛТ к длине строки на поверхности объекта. Таким образом, чем короче строки на объекте, тем выше увеличение микроскопа. Дефокусировка и астигматизм электронного луча на выходе отклоняющей системы компенсируются линзой конечной фокусировки и стигматором. Конечный диаметр луча на поверхности объекта может быть уменьшен линзами до 5 нм и менее. Объектный столик СЭМ позволяет перемещать образец не только в горизонтальной, но и вертикальной плоскости, а также наклонять и вращать его, вводя в сканируемую зону различные участки поверхности (см. рис. 2).

Электроны, составляющие первичный электронный луч (первичные электроны), имеют кинетическую энергию от 1 до 40 кэВ (она численно равна ускоряющему напряжению электронной пушки). Взаимодействуя с электронными оболочками атомов вещества объекта, они вызывают различные перераспределения энергии между оболочками, что приводит к возникновению широкого спектра вторичных излучений (см. рис. 3). Вторичные излучения обязательно возникают при электронной бомбардировке вещества, но относительная интенсивность каждого из них варьирует в зависимости от параметров первичного электронного луча и характеристик облучаемой поверхности рельефа, химического состава, электропроводности и т. п.

При изменении указанных характеристик поверхности объекта вдоль каждой строки сканирования в соответствии с его структурой одновременно изменяется и интенсивность каждого из вторичных излучений. Изменения их интенсивности преобразуются соответствующими детекторами в изменения амплитуды электрических сигналов, которые после усиления и специальной обработки поступают на модулятор ЭЛТ и модулируют яркость свечения экрана в соответствии с изменениями характеристик поверхности объекта. Поскольку перемещения электронных лучей по поверхности объекта и люминесцентному экрану ЭЛТ происходят синхронно (развертки осуществляются от одного генератора пилообразных напряжений), то каждая точка экрана соответствует точке поверхности объекта, а яркость ее свечения - интенсивности вторичного излучения, возникающего при электронной бомбардировке этой точки поверхности. Выбор вторичного излучения, несущего информацию о поверхности, производится путем подключения нужного детектора к входу видеоусилителя. Естественно, что для регистрации каждого вида вторичного излучения требуется свой детектор, чувствительность которого к данному излучению максимальна. Количество детекторов, имеющихся в СЭМ, зависит от класса прибора (чем выше класс, тем их больше).

При исследовании биологических объектов с помощью СЭМ интерес представляет прежде всего рельеф их поверхности, поэтому в качестве регистрируемого вторичного излучения выбирают, как правило, вторичные электроны. Это электроны внешних оболочек атомов вещества объекта, напыленного металлом. Покинуть пределы объекта они могут только из тонкого поверхностного слоя толщиной около 10 нм в непосредственной близости от места бомбардировки. Зона вторично-электронной эмиссии почти равна по диаметру сечению падающего луча (см. рис. 3). Это обстоятельство, а также легкость фокусировки вторичных электронов в направлении детектора ввиду их малой энергии и наиболее высокая интенсивность вторично-электронной эмиссии в сравнении с другими вторичными излучениями, дает возможность получить самую высокую разрешающую способность СЭМ именно в режиме регистрации вторичных электронов.

Имеется определенная зависимость интенсивности вторично-электронной эмиссии от угла падения электронного луча на поверхность объекта (см. рис. 4). Если состав поверхности постоянен по всей площади сканирования, то картина распределения интенсивности вторично-электронной эмиссии по этой площади будет соответствовать рельефу поверхности, т. е. изменениям угла наклона микроучастков по отношению к направлению падения луча. Это свойство делает режим регистрации вторичных электронов основным при морфологических исследованиях. Эта зависимость нелинейная, поэтому картина распределения вторично-электронной эмиссии полностью не соответствует рельефному изображению при обычном рассеянном свете. Так, например, сферические структуры выглядят несколько сплюснутыми, что необходимо учитывать при интерпретации данных и при количественной обработке изображений (см. рис. 4).

Таким образом, регистрация вторичных электронов является основным режимом работы СЭМ при изучении биологических объектов, но в отдельных случаях используются другие, дополнительные детекторы и усилительно-преобразовательные приставки, позволяющие получать изображения, формируемые упругорассеянными (отраженными), проходящими, поглощенными электронами, Оже-электронами, а также катодолюминесцентные и рентгеновские изображения и спектры.

Интенсивность упругого рассеивания электронов зависит от топографии поверхности (разрешающая способность СЭМ в этом режиме примерно па порядок меньше, чем при работе в режиме вторичных электронов), а также от среднего значения атомных номеров элементов, входящих в состав микроучастков поверхности. Изображения в упругорассеянных электронах (композиционные, или "Z-контрастные", изображения) позволяют выявить микроучастки, обогащенные какими-либо относительно тяжелыми элементами, например места накопления токсических веществ в тканях, инородные минеральные включения, а также дают возможность контрастировать тяжелыми металлами отдельные структуры (например, границы клеток контрастируются солями серебра).

Проходящие электроны используются в СЭМ для исследования тонкопленочных образцов и срезов биологического материала. Этот режим известен как трансмиссионно-сканирующая электронная микроскопия и позволяет получать четкие (с разрешающей способностью до 3 нм) изображения срезов толщиной до 1 мкм, что невозможно сделать в просвечивающих микроскопах из-за резкого ухудшения разрешающей способности за счет хроматической аберрации и теплового разрушения срезов.

Регистрация катодолюминесценции, т. е. видимого, или инфракрасного излучения, испускаемого под действием электронной бомбардировки микроучастков поверхности, содержащих люминесцирующие вещества - перспективное направление использования СЭМ в биологии. Область их применения та же, что и у люминесцентной микроскопии с ультрафиолетовым возбуждением, по разрешающая способность СЭМ при работе в этом режиме может быть существенно выше, чем у световых люминесцентных микроскопов. К сожалению, серийно выпускаемые катодолюминесцентные детекторы для СЭМ имеют настолько низкую чувствительность, что область их практического применения ограничена изучением лишь минеральных люминофоров. Высокочувствительные детекторные системы с эллиптическими зеркалами изготавливаются пока только в опытном порядке.

Регистрация тока поглощенных электронов дает информацию об электропроводности и композиции поверхности. В биологических исследованиях этот режим не используется.

Регистрация и спектрометрия Оже-электронов и характеристического рентгеновского излучения, испускаемых атомами вещества объекта, возбужденных электронной бомбардировкой, дает информацию об элементном составе поверхностного слоя и может использоваться для проведения локального элементного анализа. Поскольку энергия рентгеновских фотонов и Оже-электронов квантована и каждый химический элемент имеет присущий только ему рентгеновский и Оже-электронный спектры, регистрация этих излучений и их спектрометрия позволяют с высокой точностью и локальностью порядка 1 мкм анализировать состав микроструктур.

Существуют 3 разновидности рентгеноспектрального микроанализа и Оже-электронной спектрометрии по величине анализируемой области: 1) в "точке" (без сканирования), когда тонко сфокусированный электронный луч нацеливается на анализируемую микроструктуру по вторично-электронному изображению и регистрируется элементный состав возбуждаемой зоны размером несколько кубических микрометров; 2) по линии, когда луч сканирует одну строку, пересекающую исследуемые структуры, и на экране СЭМ воспроизводится профиль концентрации одного из элементов вдоль этой строки; 3) по площади (элементное картирование), когда на экране СЭМ воспроизводится картина распределения элемента по полю зрения, соответствующему предварительно зафиксированному вторично-электронному изображению.

Очень интересными и перспективными методами анализа являются сочетание Оже-электронной спектрометрии с ионным травлением поверхности образца, а также вторично-ионная масс-спектрометрия. Эти методы позволяют анализировать изменение состава по глубине и хорошо дополняют данные рентгеноспектрального микроанализа.

Рентгеновская и Оже-электронная спектрометрии на базе СЭМ являются экспресс-методами неразрушающего химического микроанализа, но, к сожалению, они очень медленно внедряются в биологические исследования. Это объясняется, во-первых, методическими трудностями анализа следов элементов, распределенных в легкой органической матрице, что приводит к снижению реальной чувствительности и ухудшению локальности анализа; во-вторых, высокой стоимостью спектрометров, сравнимой со стоимостью самих СЭМ.

Разрешающая способность СЭМ в значительно большей степени зависит от выбранного режима работы микроскопа и способа подготовки образца, чем при просвечивающей электронной микроскопии. В формировании изображений в СЭМ участвует не только электронно-оптическая система, как в просвечивающих микроскопах, но также и система регистрации вторичных излучений, детекторы и усилительно-преобразовательная электроника, добавляющие к полезному информационному сигналу собственные шумы. Поэтому разрешающая способность СЭМ для каждого конкретного препарата, помимо параметров оптической системы, определяется величиной отношения сигнал/шум. Основная причина шумов в СЭМ ^заключается в дискретном характере регистрируемых вторичных излучений, и практический путь повышения отношения сигнал/шум - это всемерное повышение уровня полезного сигнала за счет увеличения выхода вторичного излучения (практические рекомендации даны в разделе, касающемся подготовки образцов).

Практически при условии выбора оптимального режима работы СЭМ (достаточно высокое ускоряющее напряжение, короткое рабочее расстояние, оптимальный угол наклона образца и разумный выбор диаметра электронного луча) для большинства биологических образцов достигается разрешающая способность порядка 10 нм на СЭМ с вольфрамовым термокатодом (что соответствует полезным увеличениям 50-60 тыс. крат) и порядка 5 нм на СЭМ с электронными пушками, яркость которых повышена за счет применения катодов из гекса-борида лантана или полевой эмиссии (при этом полезные увеличения достигают 100-150 тыс. крат).

Глубина фокуса. Одной из замечательных особенностей СЭМ является большая глубина резко изображаемого пространства (глубина фокуса). Она зависит от выбранного увеличения, рабочего расстояния (от конечной линзы до образца) и диаметра диафрагмы конечной линзы. При одних и тех же увеличениях глубина фокуса СЭМ примерно на 2 порядка выше, чем у светооптических микроскопов. Это дает СЭМ огромные преимущества и значительно расширяет область его применения, поскольку позволяет фотографировать целиком образцы тканей и целые органы. Однако, поскольку СЭМ в режиме регистрации вторичных электронов плохо прорабатывает слабо выраженные, сглаженные детали рельефа (это объясняется малой интенсивностью вторично-электронной эмиссии при близких к 0® углах падения электронного луча), то для повышения топографического контраста часто прибегают к значительному (до 45®) наклону объектного столика, и в этих случаях даже относительно большая глубина фокуса не дает возможности получить резкое изображение по всему полю зрения. В таких случаях пользуются методом динамического фокусирования, который состоит в том, что к постоянному току, питающему обмотку конечной линзы и определяющему положение ее фокальной плоскости, добавляют пилообразную составляющую от генератора кадровой развертки. В итоге фокальная плоскость наклоняется вместе с плоскостью объектного столика и глубина фокуса начинает охватывать все поле зрения.

Фотографирование объектов. Любой современный научный прибор, дающий информацию об объекте исследования в форме изображения, снабжается блоком фиксирования этой информации. Только в этом случае возможна объективная оценка и последующая обработка полученных данных. СЭМ в этом смысле весьма удобен, так как позволяет представить визуальную информацию в удобной для фотографирования форме. Во-первых, СЭМ имеют широкие пределы регулирования фоновой яркости и контраста изображения, что позволяет обойтись без применения специальных высококонтрастных фотоматериалов и снимать изображения на широко распространенные фотопленки типа "Фото-65" и "Фото-130" шириной 35 и 70 мм или использовать фотокомплекты "Поляроид" для быстрого получения позитивных изображений на бумаге. Режим обработки пленок не отличается от стандартного. Во-вторых, изменив полярность видеосигнала, можно получить на экране негативное изображение, а на фотопленке соответственно позитивное, т. е. готовый диапозитив любого формата, удобного для демонстрации. В-третьих, дисплей СЭМ обычно снабжен устройством для индикации цифровых данных, таких как коэффициент увеличения, порядковый номер кадра, ускоряющее напряжение, рабочее расстояние и т. д. В современных моделях СЭМ на экране воспроизводится также масштабный отрезок (микронный маркер). Эти данные отпечатываются на фотопленке рядом с изображением или на его фоне, что экономит время исследователя, избавляя его от необходимости делать подробные записи при просмотре препаратов, а также при фотопечати с полученных негативов.

Для получения высококачественных микрофотографий используют медленные развертки с числом строк не менее 2000 и вертикальной скоростью не менее 50 с на кадр, повышая таким образом плотность электронного облучения поверхности и улучшая отношение сигнал/шум.

С помощью СЭМ можно получать стереомикрофотографии (стереопары). Для этого делают 2 снимка с одного и того же участка образца, причем для второго снимка его наклоняют на 5-10® по отношению к первоначальному положению, сохраняя при этом центральную деталь поля зрения в центре экрана. Полученные фотоотпечатки монтируют на одном листе бумаги с соблюдением взаимного расположения правого и левого снимков и рассматривают в стереоскоп. Существуют специальные стереометрические устройства, позволяющие рассчитывать по стереопарам истинные расстояния между точками изображенной поверхности и восстанавливать взаимное расположение структур в пространстве.

Аппаратура для подготовки образцов биологических объектов к исследованию. Во время исследования образцов в СЭМ они подвергаются воздействию глубокого вакуума и интенсивной бомбардировке ускоренными электронами. Биологические образцы, содержащие, как правило, большое количество связанной воды, в этих условиях деформируются вследствие быстрого ее испарения, а также действия сил поверхностного натяжения, стремящихся сократить поверхность и приводящих к ее сморщиванию. Эти воздействия, а также нагрев и накопление зарядов на их поверхности приводят к серьезным повреждениям поверхностных структур и делают необходимой специальную подготовку образцов перед просмотром в СЭМ.

Подготовка в наиболее полном варианте включает этапы химической фиксации, промывку, обезвоживание органическими растворителями, высушивание (удаление растворителей), монтирование образца на электропроводном основании в нужном положении и, наконец, напыление на поверхность тонкой пленки тяжелого металла для исключения эффектов накопления зарядов и повышения выхода вторичных электронов. Две из перечисленных операций требуют специальной аппаратуры: 1) высушивание, проводимое в специальных камерах высокого давления методом обхода критической точки (метод ВКТ), или в криогенных вакуумных установках (метод замораживания - высушивания); 2) напыление металла, проводимое в вакуумно-испарительных или ионораспылительных установках. Принцип действия этцх установок описан в разделе о подготовке образцов. Внешний вид напылительных установок и прибора для высушивания обходом критической точки показан на рис. 5, 6, 7.

Методические основы подготовки биологических объектов

Условия, в которых оказывается биологический объект в процессе СЭ микроскопии (высокий вакуум, воздействие электронного зонда), делают практически невозможным наблюдение клеток и тканей в нативном состоянии. Предварительная подготовка призвана придать биологическому объекту необходимую устойчивость к повреждающим воздействиям; наряду с этим сама подготовка не должна изменить прижизненные морфологические характеристики объекта.

Для морфологов вопросы адекватной предварительной подготовки биологических объектов всегда были важны. Как структурная организация ткани, так и различные внутриклеточные образования могут претерпевать значительные изменения при неадекватных методах фиксации, обезвоживания объекта; в ряде случаев это может обусловить серьезные ошибки в интерпретации данных. В полной мере, однако, значение этой проблемы выявилось, когда в биологии и медицине все более широкое применение стала находить СЭ микроскопия, впервые позволившая исследовать морфологию поверхности различных клеток и тканей. Клеточная поверхность непосредственно контактирует с внешней для клетки средой и "открыта" для прямого воздействия различных (в том числе и неблагоприятных) факторов этой среды, могущих быстро и существенно изменить морфологические характеристики клеточной поверхности. Поэтому вопросы адекватной подготовки клеточных и тканевых объектов к СЭ микроскопии с целью максимального сохранения их прижизненной морфологии особенно важны.

В зависимости от характера объекта его подготовка к СЭ микроскопии может в той или иной степени, меняться. Однако целый ряд определенных требований остается, постоянным и должен строго соблюдаться.

Поверхности биологических объектов можно условно отнести к двум категориям: "естественным", и "искусственным".

К первой категории относятся поверхности различных типов клеток, существующих в изолированном (или относительно изолированном) состоянии. Это Клетки, культивируемые in vitro, клетки крови и костного мозга, макрофаги экссудатов, гаметы, клетки асцитных опухолей, одноклеточные, микроорганизмы. К этой же категории относятся наружные или внутриполостные тканевые поверхности: наружные покровы, эпителиальные, эндотелиальные и мезотелиальные выстилки, а также некоторые твердые ткани, например зубная эмаль.

Ко второй категории относятся поверхности внутритканевых и внутриклеточных образований, выявляемые с помощью специальных методов (например, механического препарирования ткани).

Для подавляющего большинства биологических объектов основными этапами подготовки для исследования в СЭМ. являются: 1) предфиксационная обработка; 2) фиксация; 3) обезвоживание и высушивание; 4) обеспечение электропроводности.

Предфиксационная обработка. Эта процедура сводится в основном к "очистке" поверхности, подлежащей изучению. В такой "очистке" особенно нуждаются тканевые поверхности, обычно покрытые слизью или кровяной плазмой, маскирующими различные поверхностные образования. Поэтому тканевые поверхности, предназначенные для исследования в СЭМ, необходимо перед фиксацией осторожно промыть. Промывка клеточных культур непосредственно перед фиксацией предупреждает возможность осаждения на поверхности клеток сывороточного белка культуральной среды.

Обязательным требованием к промывочной жидкости является соответствие ее состава, тоничности, плотности, рН и температуры потребностям клеток данного типа. Так, для промывания тканей и клеток, полученных от теплокровных животных, используют сбалансированные солевые забуференные растворы или безбелковые культуральные среды с тоничностью около 0,3 осмомоля (это осмотическое давление является изотоническим для большинства клеток млекопитающих и птиц), сохраняющие на воздухе рН в пределах 7,3-7,4 и подогретые до 37-38 ®С.

Фиксация. Целью фиксации биологического объекта является максимальное сохранение его прижизненной морфологии. Фиксированный объект становится гораздо более резистентен к различным воздействиям (механическим, осмотическим и т. д.) в ходе его дальнейшей подготовки к СЭ микроскопии. Фиксация облегчает последующую дегидратацию объекта.

Фиксирующие агенты, используемые в СЭ микроскопии, относятся к альдегидам (глутаральдегид, формальдегид) и металлам (четырехокись осмия).

Альдегиды эффективно "сшивают" клеточные белки. При этом альдегиды вступают в соединение с различными функциональными группами белков (в частности, с аминогруппами), во многих случаях образуя между ними связи тийа химических мостиков. По своей способности сохранять различные морфологические образования клеточной поверхности и тонкие внутриклеточные структуры глутаральдегид превосходит формальдегид и является наиболее подходящим фиксатором для СЭ микроскопии.

В отличие от белков ненасыщенные липидные и фосфолипидные компоненты клетки, по-видимому, не стабилизируются альдегидами. Фиксация этих компонентов осуществляется с помощью четырехокиси осмия, которая взаимодействует с клеточными липидами (по месту двойных связей), образуя поперечные связи между соседними молекулами.

Клеточные или тканевые объекты вначале фиксируют альдегидами, а затем - четырехокисью осмия. Хотя альдегидная фиксация часто дает хорошие результаты и без дополнительной осмиевой фиксации, последняя оказывается необходимой для объектов, богатых липидами (например, ткани мозга). Липидные компоненты не стабилизируются при фиксации альдегидами и при пропуске дополнительной фиксации четырехокисью осмия эти вещества растворяются и удаляются из объекта в ходе его последующего обезвоживания в органических растворителях. Такое "вымывание" липидов может отразиться на морфологических характеристиках биологического объекта. Другим доводом в пользу проведения дополнительной осмиевой фиксации является обеспечение с ее помощью более высокой электропроводности клеток и в результате достижение более высокой разрешающей способности при СЭ микроскопии.

Альдегидная фиксация. К альдегидному фиксатору предъявляются те же требования, касающиеся тоничности, рН и температуры, что и к промывочной жидкости (см. выше). Особенно важны показатели тоничности: использование гипертонического фиксатора ведет к уплощению клеток, сопровождающемуся выбуханием внутриклеточных структур; гипотонический фиксатор вызывает образование крупных пузыревидных выбуханий клеточной поверхности. Поскольку осмотическое воздействие фиксатора на биологический объект определяется осмотичностью лишь буферного раствора, на котором приготовлен фиксатор, то используемый буфер должен быть изотоническим.

В соответствии с указанными выше требованиями в качестве альдегидного фиксатора при СЭ микроскопии чаще всего используют теплый 1-3% раствор глутаральдегида, приготовленный на 0,15 М натрий-кокадилатном или фосфатном буфере.

Фиксатор должен иметь "физиологическую" (37-38 ®С) температуру лишь в начальный период его воздействия; всю дальнейшую фиксацию можно продолжать при комнатной температуре. При необходимости продлить фиксацию на сутки и более рекомендуется перенести объект в том же или в свежем фиксаторе в холодильник и сохранять при температуре 5-6®С.

Продолжительность фиксации глутаральдегидом зависит от характеристик биологического объекта (размеров, степени плотности и др.) и может варьировать от нескольких часов до нескольких недель и даже месяцев.

Отмывание от альдегидного фиксатора. По окончании фиксации объект отмывают от глутаральдегида забуференным изотоническим раствором.

Дополнительная фиксация четырехокисью осмия. Отмытые клетки или ткани подвергают дополнительной фиксации 1% раствором OsO₄, приготовленным на 0,15 М натрий-кокадилатном или фосфатном буфере. Фиксация длится 30 мин- 1 ч при комнатной температуре.

Отмывание от осмиевого фиксатора. После завершения осмиевой фиксации объект тщательно отмывают в дистиллированной воде; промывание способствует удалению растворимых солей, могущих вызвать "засорение" клеток после их высушивания.

Обезвоживание и высушивание. Необходимость устранения влаги из фиксированных клеток диктуется условиями высокого вакуума (10^-4-10^-6 мм рт. ст.), в которых оказывается объект в процессе СЭ микроскопии: при наличии в клетках воды происходит ее вскипание и формирование крупных кристаллов льда, вызывающих сильные повреждения лабильных биологических структур. Повреждающее воздействие может также быть обусловлено силами поверхностного натяжения, возникающими при испарении воды из клеток.

Обезвоживание биологического объекта достигается последовательной заменой в нем воды органическими растворителями. Так, например, можно использовать серию водных растворов этанола или ацетона восходящей концентрации (до 100%); из абсолютного этанола объект можно далее провести через серию амилацетат-этаноловых смесей восходящей концентрации (до 100% амилацетата) и т. д. Обезвоженный объект высушивают с помощью одного из описываемых ниже методов.

Высушивание на воздухе. В первые годы применения СЭ микроскопии в биологических исследованиях этот простой метод использовался повсеместно. Данный метод имеет, однако, очень серьезный недостаток. В процессе испарения жидкости, в которую погружен биологический объект, граница раздела фаз "жидкость - воздух" проходит через объект, поэтому он подвергается значительному механическому воздействию силы поверхностного натяжения. Микроскопическая структура типа микроворсинки диаметром 10~5 см при высушивании на воздухе испытывает давление вдоль оси, равное примерно 28 атм. Даже при замене воды органическим растворителем с более низким поверхностным натяжением (ацетон, этанол) действие последнего на фиксированный объект при его высушивании на воздухе оказывается достаточным, чтобы обусловить: 1) сжатие объекта до 40% от его первоначального объема; 2) сглаживание рельефа клеточной поверхности в результате "полегания" различных поверхностных образований: Микроворсинок, ресничек и т. п. (рис. 8, 9); 3) формирование ложных морфологических структур, имитирующих истинные прижизненные образования клеточной поверхности (рис. 10- 12) [Ровенский Ю. А., 1979].

В связи с опасностью возникновения указанных артефактных изменений высушиванию на воздухе в настоящее время подвергают лишь "твердые" биологические объекты (минерализованные ткани и др.).

В подавляющем большинстве случаев для высушивания тканевых объектов повсеместно используют методы, позволяющие избежать деформирующего действия поверхностного натяжения. Этими методами являются высушивание переходом критической точки и замораживание - высушивание.

Высушивание переходом критической точки (ВКТ). Этот эффективный метод впервые был разработан Андерсоном в 1951 г. для высушивания биологических объектов, подготавливаемых к просвечивающей электронной микроскопии; наибольшее применение, однако, данный метод нашел в подготовке клеток и тканей к СЭ микроскопии. В настоящее время ВКТ является наиболее популярным методом высушивания биологических объектов.

Метод ВКТ основан на следующих физических закономерностях. При нагревании жидкости, заключенной в герметический сосуд, плотность жидкости постепенно снижается в результате термического расширения, а плотность насыщающего пара возрастает. С продолжением нагревания может быть достигнута так называемая критическая точка, которая характеризуется определенными (для данной жидкости) критическими значениями температуры (t_KP.) и давления насыщающего пара (р^Кр.). В критической точке исчезают различия в физических свойствах между жидкостью и паром, находящимися в равновесии: плотности жидкой и газообразной фаз становятся одинаковыми, а граница раздела между ними исчезает. При значениях температуры и давления за пределами критической точки существует лишь одна газообразная фаза.

Таким образом, если жидкость с погруженным в нее биологическим объектом поместить в замкнутый сосуд и подвергнуть нагреванию до температуры выше критической, то объект окажется в газовой среде (т. е. высушенным), избежав повреждающего воздействия силы поверхностного натяжения.

Подвергать ВКТ обводненные биологические объекты нецелесообразно, так как вода обладает очень высокими критическими температурой и давлением (374®С; 217,7 атм). Поэтому воду в объекте необходимо сначала заместить так называемой переходной жидкостью, обладающей значительно более низкими t_KP. и р_кр.. В качестве таковой чаще всего используют сжиженный СО₂ (t_кp. = 31,1 ®С; р_кр. = 72,8 атм). Поскольку эта переходная жидкость плохо смешивается с водой и потому не способна прямо заместить ее в объекте, последний вначале подвергают дегидратации этанолом, ацетоном или амилацетатом. Жидкий СО₂ хорошо смешивается с каждым из этих дегидратирующих агентов.

ВКТ осуществляют с помощью специальных аппаратов. Биологический объект, погруженный в последний из органических растворителей (например, в абсолютный ацетон), вносят в предварительно охлажденную (до 10-15 ®С) камеру, которую затем заполняют СО₂из баллона. Поступая под давлением около 60 атм в охлажденную камеру, СО₂ конденсируется в жидкость. Для того чтобы избавиться от примеси ацетона в жидком СО₂ в камере, проводят частичное "стравливание" через выпускной клапан при сохранении поступления в камеру свежих порций СО₂. После нескольких таких "стравливаний" камеру вновь заполняют жидким СО₂, герметизируют и нагревают до температуры выше критической (примерно до 42 ®С). С подъемом температуры возрастает и давление в камере. По достижении критической точки жидкий СО₂ переходит в газообразное состояние. Пока температура поддерживается выше критической, это состояние сохраняется, и газ может быть выпущен из камеры, оставляя объект высушенным.

Замораживание - высушивание. Метод "замораживания- высушивания" заключается в быстром замораживании биологического объекта с последующей сублимацией льда в условиях высокого вакуума. Этот метод, как и ВКТ, позволяет избежать образования границы раздела "жидкость - газ" и связанного с ней повреждающего воздействия на объект. При замораживании биологического объекта свободная вода, содержащаяся в цитоплазме и межклеточных промежутках, замерзая, кристаллизуется. В случае образования крупных кристаллов льда последние могут вызвать смещения и механические повреждения различных биологических структур. Предупредить формирование крупных ледяных кристаллов можно максимальным увеличением скорости замораживания объекта, а также предварительным замещением воды в объекте различными криопротекторами.

Рост кристаллов льда происходит с наибольшей интенсивностью в температурном интервале от нуля до -30®-40 ®С, поэтому, если небольшой биологический объект максимально быстро охладить до -80 ®С и ниже, то удастся "проскочить" эту температурную зону: крупные кристаллы льда не успевают сформироваться. Обычно объекты замораживают во фреоне 12, охлаждаемом жидким азотом (температура фреона -155 ®С), в результате чего достигается практически мгновенное замораживание. Замороженные объекты переносят в жидкий азот.

В качестве криопротекторов в СЭ микроскопии чаще всего применяют этанол, ацетон или амилацетат. Так, например, образование кристаллов льда при замораживании клеток значительно снижается в случае предварительного замещения воды 70% этанолом.

Высушивание замороженных объектов осуществляется путем помещения их под тонким слоем жидкого азота в специальную герметизированную камеру, предварительно охлажденную до -60®-80 ®С, в которой создается высокий вакуум.

Обеспечение электропроводности. Если биологический объект обладает низкой электропроводностью и (или) неплотно прилегает к поверхности держателя, то при сканировании электронным зондом объект будет заряжаться. Очаги заряжения могут возникать как на поверхности, так и в глубине объекта.

Заряжение вызывает серьезные искажения в получаемом СЭМ изображении: возникают "островки" ярких пятен, маскирующих истинную топографическую картину поверхности объекта; заряжение может также снизить разрешающую способность; неравномерный спорадический характер заряжения обусловливает появление нерегулярных ярких и темных полос поперек изображения.

Заряжение биологического объекта можно ослабить снижением ускоряющего напряжения или применением быстрой (телевизионной) скорости сканирования. Однако для достижения высокой степени разрешения приходится прибегать к специальным мерам обеспечения электропроводности. Главной мерой является покрытие объекта слоем металла. В таком покрытии нуждаются почти все биологические объекты, поскольку в обезвоженном и высушенном состоянии они имеют низкую электропроводность. Покрытие металлом предотвращает образование электрических зарядов на поверхности объекта, способствует отведению тепла, генерируемого взаимодействием электронов зонда с объектом (перегревание объекта в процессе СЭ микроскопии может вызвать смещение и повреждение объекта), способствует достижению более высокой разрешающей способности и механически стабилизирует поверхность объекта.

Покрытие должно удовлетворять определенным требованиям. Слой металла должен быть сплошным и иметь всюду одинаковую толщину, независимо от расположения и ориентации отдельных элементов рельефа поверхности объекта. Структура самого покрытия не должна выявляться при максимально высокой разрешающей способности СЭМ (5 нм и менее). Толщина слоя металла не должна быть настолько малой, чтобы покрытие легко нарушалось и не настолько большой, чтобы скрыть тонкие детали рельефа или исказить их истинные размеры. Обычная толщина покрытия составляет примерно 10- 20 нм. Для создания покрытия используют тяжелые металлы и их сплавы: Au, Pt, Ag, Au/Pd, Pt/Pd. Все они хорошо эмитируют вторичные электроны, легко испаряются при нагревании (см. ниже) и стабильны в обычной атмосфере (за исключением Ag, подвергающегося на воздухе сульфированию).

Методы покрытия объекта металлом. Покрытие объекта производится в специальной вакуумной камере и может быть осуществлено двумя способами: путем испарения

Нагреваемого металла и путем "выбивания" атомов металла, бомбардируемого ионами инертного газа.

До недавнего времени использовалось исключительно термическое испарение металла в вакууме (evaporate coating). При этом методе тонкую проволоку (или маленькую пластинку), служащую материалом для покрытия, закрепляют на вольфрамовой нити, которая в условиях вакуума нагревается током. Проволока начинает плавиться, а затем испаряться; атомы испаряющегося металла покрывают поверхность помещенного в камеру объекта.

С целью более равномерного покрытия, а также для исключения эффекта "оттенения", объект на протяжении всей процедуры покрытия наклоняют и вращают, меняя его ориентацию относительно источника испаряющихся атомов металла.

В последнее время значительное распространение получил другой метод покрытия - ионная бомбардировка, заключающаяся в том, что мишень из металла (например золота) подвергается бомбардировке ионами инертного газа, в результате чего из мишени "выбиваются" атомы металла, которые и достигают поверхности объекта (sputter coating).

Этот метод обладает определенными преимуществами. Энергия атомов металла, "выбитых" ионной бомбардировкой, выше, чем энергия атомов, освобождающихся в результате термического испарения металла. Поэтому "выбитые" из мишени атомы создают более прочное покрытие. Это позволяет снизить его толщину с сохранением целостности. Поскольку весь процесс покрытия выполняется при относительно высоких давлениях, то множественные столкновения "выбитых" атомов металла способствуют лучшему их рассеиванию во всех направлениях. Это делает возможным осуществить непрерывное покрытие объектов с самой сложной топографией поверхности, притом без поворотов или наклонов объекта. Недостатком этого метода является опасность перегрева объекта (большая, чем при термическом испарении), что может вызвать, например, растрескивание клеток в монослойных культурах. В настоящее время, однако, разработаны "холодные" аппараты для ионной бомбардировки, конструкция которых предупреждает перегревание объекта.

Помимо покрытия объекта слоем металла, широко используются также импрегнационные методы, обеспечивающие электропроводность не только на поверхности, но и по всей толщине биологического объекта. Эти методы имеют преимущества и применяются в отношении различных тканевых объектов.

Выше нами были рассмотрены последовательные этапы стандартной процедуры подготовки клеточных и тканевых объектов. Однако в зависимости от задач исследования широкое применение в СЭ микроскопии находят также и различные специальные методы. Эти методы будут рассмотрены в следующем разделе.

Специальные методы препарирования биологических объектов

Сканирующая электронная микроскопия гидратированных и живых объектов сопряжена со значительными трудностями из-за необходимости создания в колонне микроскопа высокого вакуума, который ведет к быстрому обезвоживанию образцов. Сейчас разработаны специальные камеры, где электронный пучок взаимодействует с объектом в условиях сохранения остаточного атмосферного давления и влажности. Это позволило изучать с помощью СЭМ живые клетки. Конечно пока речь может идти только о переживающих объектах. СЭ микроскопия объектов в замороженном состоянии позволяет избегать химических воздействий в процессе фиксации и обезвоживания. Свежие образцы быстро охлаждают до температуры ниже -110®С для предупреждения образования кристаллов льда и переносят в специальную низкотемпературную камеру СЭМ. В этих камерах можно просматривать объект, сохраняя его в замороженном состоянии. Применяются также различные термоизолирующие криогенные приспособления, с помощью которых поддерживается низкая температура образца во время его покрытия металлом и перемещения в охлаждаемую камеру микроскопа.

Данный метод позволяет избежать перераспределения растворимых компонентов объекта и при необходимости дает возможность путем регулируемого повышения температуры проводить дозированное травление поверхности замороженного образца.

Метод СЭ микроскопии после просвечивающей электронной микроскопии основывается на том, что образец, с которого приготовлены ультратонкие срезы, погружают в растворитель для удаления заливочной среды. Эпоксидные смолы растворяют насыщенными растворами едкой щелочи на метаноле или этаноле. Для предупреждения артефактных изменений все растворы перед употреблением необходимо фильтровать. После удаления смолы кусочек обезвоживают и высушивают, как описано выше.

Метод просвечивающей электронной микроскопии после СЭ микроскопии предусматривает погружение просмотренного в СЭМ образца в растворитель, заключение его в смолу и изготовление ультратонких срезов. Существуют специальные приспособления, позволяющие маркировать участки ткани в процессе СЭ микроскопии для дальнейшего прицельного анализа в просвечивающем электронном микроскопе срезов определенных структур.

Методы выявления внутритканевых и внутриклеточных структур, скрытых в обычных условиях в глубине образцов, можно разделить на механические и химические. По классификации Ю. А. Ровенского (1979), образующиеся в этом случае при препарировании поверхности относятся к категории "искусственных".

Механическое обнажение внутритканевых структур достигается путем рассечения, разрыва или расслоения образцов как в гидратированном, так и в высушенном состоянии. Тканевые объекты можно подвергать диссекции до фиксации. В таких случаях все манипуляции следует проводить в теплом изотоническом забуференном растворе с последующим промыванием, а затем фиксацией обнажившихся "искусственных" поверхностей (результаты, однако, плохо воспроизводимые). Предпочтительно вначале фиксировать ткань, а затем подвергать ее препариванию.

На результаты препарирования высушенных объектов существенное влияние оказывают особенности их предшествующей подготовки. В случае фиксации раствором OsО₄без префиксации глутаральдегидом высушенная ткань разрывается преимущественно по межклеточным промежуткам. Это особенно выражено при использовании раствора OsО₄ на борат-тетраборатном буфере или в случае обработки фиксированной осмием ткани раствором борной кислоты. Если препарирование тканевого объекта, подготовленного указанным способом, проводить в водной среде до высушивания, то можно добиться разделения образцов на отдельные клетки, поверхность которых может быть затем изучена в СЭМ. Механизм разобщающего действия борат-ионов остается неясным.

Для обнажения базальных поверхностей однослойных клеточных пластов можно применять способы получения пленочных препаратов с помощью коллодийных пленок. Взаимоотношения клеток с подлежащими структурами удобно оценивать по образцам, приготовленным с помощью метода разрыва и расслоения высушенных тканей.

Обработка химическими агентами позволяет удалять определенные компоненты объекта и обнажать для наблюдения в СЭМ различные "скрытые" его участки. Можно использовать как фиксированные, так и нефиксированные образцы.

Часто возникает необходимость удаления коллагена, входящего в состав коллагеновых фибрилл и базальных мембран. Для этих целей фиксированные препараты обрабатывают концентрированным раствором соляной кислоты. Последующее использование коллагеназы, расщепляющей коллаген, входящий в состав базальных мембран, улучшает результаты. Данный метод позволяет изучать распределение микрососудов относительно паренхиматозных элементов. Тот же результат достигается путем воздействия на нефиксированные образцы трипсином и соляной кислотой или на фиксированные - смесью коллагеназы и трипсина.

Обработка тканей гиалуронидазой позволяет удалять основное вещество соединительной ткани, а-амилазой - визуализировать поперечную исчерченность коллагеновых волокон.

В ряде случаев возникает необходимость изучения поверхности свободных (изолированных) пограничных клеток, которые получают путем промывания полостных образований раствором коллагеназы. Чтобы избежать артефактов, связанных с изменением поверхности изолированных клеток при контакте их с субстратом, рекомендуется фиксировать клетки в суспензии [Ровенский Ю. А., 1979].

Разработаны методы избирательного сохранения определенных компонентов тканей при удалении остальных.

Для изучения архитектоники эластических элементов фиксированные образцы обрабатываются муравьиной кислотой и затем тщательно отмываются (см. рис. 136, 138). Тот же результат можно получить путем воздействия на нефиксированные препараты раствором NaOH.

Существует несколько методов, позволяющих изучать в СЭМ внутриклеточные структуры: 1) детергентное экстрагирование для анализа фибриллярных элементов; 2) ионное травление; 3) замораживание скалывание - оттаивание - травление; 4) специальные способы осмиевой фиксации. Указанные методы приближают СЭ микроскопию по возможностям к просвечивающей электронной микроскопии.

Метод авторадиографии успешно адаптирован для СЭ микроскопии. При этом сухие кусочки покрываются фотоэмульсией, подсушиваются, экспонируются и проявляются. Над мечеными структурами, например ядрами эндотелиоцитов, видны светящиеся гранулы серебра (см. рис. 130).

Гистохимия в СЭ микроскопии предусматривает маркирование на поверхности образцов определенных веществ и структур, что позволяет изучать их топографию. Так, избирательное окрашивание осмием участков с пероксидазной активностью позволило идентифицировать различные типы клеток в костном мозге, импрегнация серебром миокадра способствовала выявлению Т-тубулярной системы и т. п.

В СЭ микроскопии применяется также метод детектирования упругорассеянных электронов, излучение которых зависит от свойств изучаемой ткани. Обработка ее красителями, меняющими характеристики этого излучения, позволяет изучать тинкториальные свойства клеточных и неклеточных структур.

Метод маркировки межклеточных контактов основан на свойстве ионов серебра осаждаться в межклеточных пространствах и заключается в обработке препаратов 0,05- 0,25% раствором азотнокислого серебра. Отложение серебра вызывает свечение межклеточных пространств. Ранее для этого предпочитали использовать нефиксированные ткани. Однако сейчас доказано, что импрегнация бывает не менее удачной, если использовать кратковременную фиксацию. Поверхность эндотелия в этом случае повреждается меньше.

Для выявления рецепторов клеточной поверхности используются методы их маркировки с помощью антител или лектинов. В первом случае образцы обрабатывают нативными антителами, с которыми затем связываются субстанции, видимые в СЭМ, либо мечеными антителами. В ряде случаев применяют более сложные методы, например "гаптен-сэндвич" метод, включающий химическое модифицирование антител с помощью гаптенов. При наличии нескольких антисывороток к соответствующим антигенам можно метить различные специфические группировки на поверхности препаратов.

В основе лект и нового метода визуализации клеточных рецепторов лежит использование особого класса белков - лектинов, которые одним концом молекулы связываются со специфическими группировками гликопротеидов клеточной поверхности. Связывание с другим их концом видимых в СЭМ субстанций до (прямой метод) или после (непрямой метод) взаимодействия с изучаемой тканью позволяет оценивать распределение рецепторов на поверхности пограничных клеток.

Метод СЭ микроскопии коррозионных препаратов включает ряд этапов: отмывку полостного образования от загрязняющих его поверхность веществ (например, кровеносных сосудов от крови), введение в полость инъекционной массы, ее полимеризацию, мацерацию тканей теплыми крепкими растворами щелочи или кислоты, высушивание коррозионных препаратов, создание токопроводящего покрытия, а также некоторые специальные манипуляции, позволяющие проводить дифференцированное изучение элементов полостного образования (например, микроциркуляторного русла), маркировку межклеточных контактов и т. д.

В качестве инъекционной массы используют предполимеры метакрилатов и других подобных мономеров, различные латексы или иные многокомпонентные смолы. Для выявления структур стенки органа используют метод дозированного травления, предусматривающий неплоную мацерацию тканевых структур (см. рис. 137).

Цветокодирование при СЭ микроскопии позволяет переводить (кодировать) чёрно-белое изображение в цветное, что увеличивает разрешающую способность метода.

В последние годы началось внедрение количественных методов анализа в СЭ микроскопию. Сканирующая электронная микрофотография - это проекция трехмерного изображения па плоскость. Для определения истинных размеров структур используется прежде всего метод стереопар.

1. Схема устройства СЭМ:

1 - электронная пушка; 2- конденсорная линза; 3 - отклоняющая система; 4 - конечная линза со стигматором; 5 - объектный столик; 6 - исследуемый образец; 7 - вакуумная система; 8 - генератор развертки; 9 - блок управления увеличением (аттенюатор); 10 - селектор сигналов; 11 - блок усиления и обработки сигналов; 12 - электронно-лучевая трубка (кинескоп); 13 - отклоняющая система кинескопа. ВИ₁, ВИ₂, ВИ₃ - потоки вторичных излучений; Д₁, Д₂, Д₃ - соответствующие детекторы вторичных излучений; С₁, С₂, С₃ - соответствующие электрические сигналы; X, Y - направления сканирования (строчная и кадровая развертки); L - длина строки сканирования на экране кинескопа; 1 - длина строки сканирования на поверхности образца; ЭЛ₁, ЭЛ₂ - электронные лучи в колонне микроскопа и кинескопе.

2. Внешний вид современного СЭМ.

3. Спектр вторичных излучений, возникающих при взаимодействии электронного луча с веществом объекта. Показаны основные виды вторичных излучений и зоны их эмиссии. Пунктиром обозначены вторичные излучения, не используемые в сканирующей микроскопии биологических объектов.

4. Зависимость интенсивности вторично-электронной эмиссии от угла падения электронного луча на поверхность объекта.

- коэффициент вторичной эмиссии (относительные единицы); -угол падения электронного луча.

5. Ионно-распылительная установка, используемая для нанесения металлических покрытий в тлеющем разряде.

6. Установка для вакуумного испарения металлов.

7. Установка для высушивания биологических объектов методом перехода критической точки.

8. Неопластический фибробласт мыши (клетка линии L), фиксированный в условиях культивирования и высушенный методом, перехода критической точки. Х2800. Малоуплощенная клетка, поверхность которой покрыта множественными микроворсинками.

9. Неопластический фибробласт мыши (клетка линии L), фиксированный в культуре и высушенный на воздухе. Х2800. Клетка сильно уплощена, ее поверхность сглажена.

10. Неопластический фибробласт мыши (клетка линии L), фиксированный во взвеси и высушенный методом перехода критической точки. Х6000. Сферическая клетка, поверхность которой имеет сложный микрорельеф, состоящий из пузырей и микроворсинок.

11. Неопластический фибробласт мыши (клетка линии L), фиксированный во взвеси и высушенный на воздухе. Х6000. Сферическая клетка со сглаженной бугристой поверхностью; в основании клетки артефактные нитевидные структуры, сходные с филоподиями (псевдофилоподии).

12. Неопластический фибробласт мыши (клетка линии L), фиксированный во взвеси и высушенный на воздухе. Х6000. Клетка уплощена до полусферической формы, имеет бугристую поверхность; в основании клетки артефактная пластинчатая структура (ПЛ), сходная с ламеллоплазмой (псевдоламеллоплазма).

ГЛАВА 2. СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР

Морфология клеточной поверхности in vitro

Поверхность различных клеток в СЭМ может выглядеть либо относительно гладкой, либо, что бывает гораздо чаще, на ней наблюдаются разного рода выросты. Последние могут иметь разнообразную форму и размеры, различный характер распределения. Совокупность морфологических образований определяет топографию, или микрорельеф, клеточной поверхности.

Поскольку большинство данных, получаемых с помощью СЭ микроскопии, имеет описательный характер, следует стремиться к однозначности терминов, употребляемых для обозначения различных морфологических образований, составляющих микрорельеф клеточной поверхности. Между тем в литературе, касающейся СЭ микроскопии биологических объектов, унификация терминов не всегда соблюдается, и часто для обозначения одного и того же элемента микрорельефа разные авторы используют различные термины; один и тот же термин иногда употребляют для обозначения морфологически различных образований. Нередко используют такие неопределенные обозначения, как "неровности", "выпячивания", "грубый рельеф" и т. п. С целью внести определенный порядок в используемую терминологию и облегчить задачу описания топографической картины клеточной поверхности мы предлагаем следующую классификацию морфологических структур, наблюдаемых на поверхности различных клеток в СЭМ. Основой для ее создания явились наблюдения в СЭМ морфологических перестроек разнообразных культивируемых клеток. Рельефные образования клеточной поверхности, обнаруживаемые in situ, также приняты во внимание.

Различные морфологические образования клеточной поверхности могут быть разделены на 3 категории: нитевидные, ламеллярные и сфероидные. К первым относятся нитевидные выросты самой различной длины и более или менее одинаковой толщины; ко вторым - разнообразные пластинчатые выросты и складки; к третьим - образования, форма которых близка к сферической (табл. 1).

Таблица 1

Категории морфологических образований

Нитевидные	Ламеллярные	Сфероидные	Комбинированные
Микроворсинки	Ламеллоплазма	Пузыри	Пузырь-микроворсинка; пузырь-филоподия
Филоподии	Ламеллоподин
Ретракционные фибраллы	Раффлы		Раффл-микроворсинка; раффл-филоподия
Реснички	Складки		Складка-микроворсинка
Жгутики			Ламеллоплазма-раффл; ламеллоплазма-пузырь; ламеллоплазма-микроворсинка; ламеллоплазма-филоподия; ламеллоплазма-ретракционная фибрилла

По своей локализации все эти морфологические образования могут быть: апикальными (расположенными на верхней, дорсальной поверхности клетки), краевыми (отходящими от краев клетки) и базальными (расположенными па нижней поверхности клетки). Понятно, что такое подразделение не может быть применено к клеткам сферической формы.

Нитевидные образования

Эти образования имеют цилиндрическую (или близкую к ней) форму; их длина, как правило, значительно превосходит диаметр. К нитевидным образованиям относятся: микроворсинки, филоподии, ретракционные фибриллы, реснички и жгутики.

Микроворсинки имеют палочковидную форму с закругленной вершиной; длина колеблется от 0,2 -0,5 до 5- 6 мкм, а диаметр примерно одинаков на всем протяжении и составляет 0,1-0,15 мкм. Расположение чаще всего апикальное и краевое (см. рис. 13, 14), но может быть и базальным; у клеток сферической формы микроворсинки могут занимать всю свободную поверхность (см. рис. 15).

Микроворсинка - одно из наиболее часто наблюдаемых морфологических образований клеточной поверхности. Особенно часто микроворсинки встречаются у различных клеток в условиях культивирования. Размеры и форма этих образований могут значительно варьировать не только у разных типов клеток, но даже у одной и той же клетки. У большинства клеток микроворсинки относительно прямые, но встречаются такие, у которых часть этих образований имеет перегибы, некоторые выглядят извитыми. У отдельных типов клеток многие микроворсинки имеют локальные утолщения или оканчиваются бульбовидными расширениями; они могут также разветвляться (см. рис. 16). Распределение микроворсинок носит относительно равномерный характер, однако у некоторых типов клеток они располагаются значительно гуще в центральной части клеточной поверхности, чем на периферии (см. рис. 17). Плотность расположения микроворсинок широко варьирует у клеток разных типов (см. рис. 18, 19)-от менее 1-2 до нескольких сотен на 100 мкм2 клеточной поверхности (например, у клеток цервикального цилиндрического эпителия человека плотность микроворсинок доходит до 900/100 мкм2).

Как и большинство других морфологических образований клеточной поверхности, микроворсинки могут возникать или исчезать при различных состояниях и реакциях клетки: в процессе прохождения митотического цикла, в результате неопластической трансформации, при контактных взаимодействиях клетки с разного рода твердыми субстратами. Гормональные и различные внешние воздействия также могут влиять на состояние микроворсинок.

Так, например, агенты, оказывающие дезорганизующее действие на системы цитоскелета, обусловливают укорочение и снижение числа микроворсинок, на клеточной поверхности.

Роль микроворсинок окончательно не выяснена. Микроворсинки, возможно, служат своеобразными запасниками клеточной мембраны: согласно расчетам, одна микроворсинка диаметром 0,1 мкм и длиной 3 мкм может резервировать примерно 1 мкм2 клеточной поверхности; при наличии большого числа микроворсинок резервная поверхность весьма значительна. Этот резерв может быть использован клеткой при различных изменениях ее формы, связанных, например, с процессами деления клетки или ее распластывания на поверхности какого-либо твердого субстрата.

Предполагается также, что за счет "избыточной" клеточной поверхности, обеспечиваемой микроворсинками, может осуществляться усиленный транспорт питательных веществ (в частности, глюкозы в эпителиальных клетках проксимального отдела нефрона) в клетку и высвобождение метаболитов. "Трофическая" функция микроворсинок может осуществляться не только путем простого увеличения поглощающей поверхности. Имеются данные, указывающие на возможное участие микроворсинок в пиноцитозе, в частности, на их пространственную и структурную связь с пиноцитарными пузырьками.

Значительна также роль микроворсинок в образовании межклеточных связей (см. рис. 20).

Филоподии - нитевидные образования, которые могут достигать 10-15 мкм длины и имеют диаметр от 0,1-0,15 до 0,3-0,5 мкм. Филоподии несколько суживается к дистальному концу, который часто оказывается разветвленным; диаметр концевых участков может составлять около 0,05 мкм. Филоподии отличаются от микроворсинок следующими признаками: значительно большей длиной и (или) большим диаметром, конусовидной формой. Отличительным признаком филоподии является также то, что их дистальные концы оказываются, как правило, прикрепленными к поверхности твердого субстрата, на котором располагается клетка, или к соседним клеткам (см. рис. 21-22).

Филоподии чаще всего имеют краевое расположение (краевые филоподии иногда называют микроспайками), но иногда отходят и от апикальной поверхности клетки (см. рис. 22). Они очень часто обнаруживаются в основании клетки в начальной стадии процесса ее распластывания на твердом субстрате (см. рис. 23).

Функция филоподии не ограничивается участием в формировании контактов клетки с твердым субстратом или межклеточных контактов. Краевые филоподии могут также служить "органами" движения клеток как в условиях in vitro, так и in vivo (например, в эмбриогенезе или при регенерации). Филоподиям, по-видимому, присуща также функция своеобразных "детекторов": с помощью краевых филоподии клетка, расположенная на каком-либо твердом субстрате, может осуществлять выбор участков, оптимальных для ее прикрепления.

Ретракционные фибриллы - морфологические образования, являющиеся разновидностью филоподии. Они возникают по краю распластанной клетки при ее ретракции - сокращении, сопровождающем вступление клетки в митоз или ее постепенное отделение от поверхности твердого субстрата (см. рис. 24, 25, 26). Отличительным, хотя и непостоянным, признаком ретракционных фибрилл служат концевые расширения бульбовидной или уплощенной формы. Поскольку состояние ретракции клетки может быть с уверенностью установлено далеко не всегда (особенно в начальных стадиях ретракции), то решение вопроса о принадлежности наблюдаемых краевых филоподии к ретракционным фибриллам нередко оказывается затруднительным.

Реснички и жгутики представляют собой специализированные клеточные органеллы и лишь с оговоркой могут быть причислены к рассматриваемым здесь морфологическим образованиям клеточной поверхности. Реснички и жгутики имеются у многих одноклеточных, а в многоклеточном организме - лишь у некоторых типов специализированных клеток: мерцательного эпителия дыхательных путей (см. рис. 27) или некоторых отделов половой системы, у клеток эпендимной глии (реснички), а также у спермиев (жгутики). Разновидностью ресничек являются волоски рецепторных клеток сенсорного эпителия внутреннего уха.

Реснички значительно короче и многочисленнее жгутиков. Они примерно вдвое толще микроворсинок (0,2-0,3 мкм в диаметре) и могут достигать значительно большей длины. Реснички отличаются мономорфностью и высокой плотностью расположения на дорсальной поверхности эпителиальных клеток. Одиночные реснички длиной 10-30 мкм иногда удается обнаружить в СЭМ у эпителиальных клеток в условиях культивирования. Локомоторная функция этих высокоспециализированных структур достаточно хорошо изучена. Волоски рецепторных клеток сенсорного эпителия внутреннего уха воспринимают звуковые колебания пли изменения положения тела в пространстве.

Ламеллярные образования

Ламеллярными называются образования, имеющие более или менее плоскую конфигурацию. К ним относятся ламеллоплазма (ламеллярная цитоплазма), ламеллоподии, раффлы и складки.

У клетки, распластанной на каком-либо твердом субстрате, ламеллоплазмой (или ламеллярной цитоплазмой) называют более или менее широкую тонкую пластинку, плотно прилегающую к поверхности субстрата и не содержащую зернистости (фазовоконтрастная микроскопия). Ламеллоплазма может располагаться по всему периметру клетки или быть разделена на отдельные участки, образующие периферические зоны цитоплазмы. У движущегося фибробласта наибольший участок ламеллоплазмы располагается на переднем (ведущем) конце клетки и имеет вид веерообразной пластинки, называемой также передней или ведущей ламеллой (см. рис. 30). В ранних фазах процесса распластывания клетки на субстрате ламеллоплазма в виде циркулярной пластинки обнаруживается в основании клетки (см. рис. 29).

Ламеллоподии - сравнительно небольшие (2-5 мкм) пластинчатые выросты, прилегающие к поверхности твердого субстрата, на котором располагается клетка. Локализуются на свободном крае ламеллоплазмы. Ламеллоподии наблюдаются также в основании клетки в начальной стадии процесса распластывания на субстрате (см. рис. 28).

Раффлы - пластинчатые выросты, имеющие в СЭМ вид "оборок", отличающиеся от ламеллоподии. Во-первых, они всегда более или менее высоко приподняты над поверхностью твердого субстрата (см. рис. 31, 32); во-вторых, могут иметь не только краевое, но и апикальное расположение, а также располагаться на свободной поверхности клеток сферической формы (см. рис. 40). Подобно филоподиям или ламеллоподиям, раффлы могут наблюдаться, кроме того, в основании клетки в начальных стадиях ее перехода от сферической формы к распластанному состоянию (см. рис. 32).

Высота раффлов значительно варьирует, но чаще бывает порядка 6-8 мкм, а протяженность на поверхности клетки может доходить до 8-10 мкм; толщина около 0,1-0,15 мкм.

Раффлы встречаются с разной частотой в зависимости от их локализации. Наиболее часто они возникают на свободном крае клетки (см. рис. 31), чаще - на переднем (ведущем) крае движущегося фибробласта в культуре. Реже встречаются клетки с апикальными раффлами.

Раффлы - динамические образования: период между возникновением раффла и его исчезновением (в случае неприкрепления к субстрату) составляет менее 1 мин. На месте исчезнувшего раффла нередко остаются нитевидные структуры типа хаотически расположенных апикальных филоподии, предположительно рассматриваемых некоторыми авторами как цитоскелетные элементы коллаптирующего раффла.

Раффлы могут способствовать метаболическим функциям клеток, обеспечивая дополнительную поглощающую поверхность. Эта "избыточная" поверхность может быть весьма значительна и составлять только для одного раффла около 100 мкм². Поглощение питательных веществ раффлами может осуществляться также путем пиноцитоза. Доказано участие раффлов в захватывании небольших капель культуральной среды. Раффлы могут, по-видимому, также участвовать и в фагоцитозе, осуществляя захватывание остатков клеток.

Складки - гребневидные выросты, имеющие апикальное расположение; у сферических клеток складки могут наблюдаться на всей свободной поверхности (см. рис. 40). В отличие от апикальных раффлов, высота складок не превышает 1 мкм.

Складки являются относительно стабильными морфологическими образованиями. Они встречаются обычно в сочетании с другими элементами рельефа (например, с микроворсинками), но у некоторых клеток складки могут доминировать в микрорельефе поверхности.

Складчатый микрорельеф эпителиальных клеток ряда слизистых оболочек (пищевода, шейки матки и др.), по-видимому, может способствовать сохранению слизи, осуществляя, таким образом, протективную функцию.

Сфероидные образования

Чаще всего сфероидные образования обозначают термином "пузыри". Другие названия: зейотические (zeiotic) пузыри, луковицеобразные выросты, экзоциты.

Пузыри - выпячивания сферической или почти сферической формы с гладкой поверхностью и диаметром от менее 1 до нескольких микрометров.

Расположение пузырей- апикальное и краевое (см. рис. 33); у клеток сферической формы они могут занимать всю свободную поверхность (см. рис. 37).

С помощью световой микроскопии или микрокиносъемки исследователи уже давно наблюдали на поверхности клеток в конце митоза своеобразную картину "вскипания": быстрого появления и исчезновения множественных пузыревидных выростов. Образование весьма крупных пузырей, которые, однако, уже не втягиваются обратно в клетку, можно также видеть при различных неблагоприятных воздействиях, например при помещении клетки в гипотонический раствор; иногда такие пузыри "отшнуровываются" от клетки и выбрасываются в окружающую среду (процесс микроклазматоза).

СЭ микроскопия показала, что пузыри могут входить в со став микрорельефа поверхности многих типов клеток в культуре, причем не только в митозе, но и в интерфазе. В СЭМ под достаточно большим углом зрения часто удается видеть, что пузырь находится на короткой и толстой (немного меньше диаметра самого пузыря) "ножке". Количество пузырей может быть самым различным, а расположение - более или менее равномерным или в виде отдельных компактных скоплений.

Пузыри- динамическое образование. Формирование пузыря занимает несколько секунд, после чего он в течение примерно 1 мин подвергается ретракции.

В пузырях также может, по-видимому, резервироваться "избыточная" клеточная поверхность, реализуемая при переходе сферической клетки к распластанному состоянию. Пузыри, подобно филоподиям, могут выполнять функцию "органов" движения клеток в условиях in vivo, например в эмбриогенезе. Ядросодержащие возвышения встречаются на поверхности распластанных клеток в культуре ткани или в клетках однослойных плоских эпителиев, например заднего эпителия роговицы (см. рис. 51). Они обусловлены выбуханием клеточных ядер (в результате высокой степени распластанности клеток) и поэтому не могут быть причислены к истинным морфологическим образованиям клеточной поверхности.

Комбинированные формы образований

Наряду с перечисленными выше образованиями, морфологическая принадлежность которых в большинстве случаев представляется достаточно отчетливой, нередко встречаются комбинированные формы: а) пузырь -микроворсинка, филой о д и я. Иногда микроворсинка или филоподия "выходит" из пузыря, расположенного в ее основании. Встречаются микроворсинки с пузыревидным расширением на конце (см. рис. 34); б)раффл - микроворсинка, филоподия. В некоторых случаях от края раффла отходят короткие или более длинные нити типа микроворсинок или филоподии (см. рис.35); в) складка - микроворсинка. Микроворсинка может отходить от складки; г) ламеллоплазма - раффл (микроворсинка, пузырь, филоподия, ретракционная фибрилла). На апикальной поверхности ламеллоплазмы могут располагаться микроворсинки, пузыри или раффлы; те же образования (в особенности раффлы), а также филоподии и ретракционные фибриллы нередко отходят от края ламеллоплазмы (см. рис. 36).

Описанные выше морфологические образования клеточной поверхности могут иногда так видоизменяться, что их бывает трудно различить. Например, резко укороченные микроворсинки становятся сходными с мелкими пузырями; утолщенные короткие складки бывает трудно отличить от деформированных пузырей и т. д. Кроме выростов, на поверхности клеток в СЭМ видны углубления: различной формы ямки и бороздки. Круглые ямки диаметром 40-60 нм соответствуют прикрепленным микропиноцитозным везикулам и называются кавеолами.

Типы микрорельефа клеточной поверхности

Выше были рассмотрены различные морфологические образования, формирующие определенный микрорельеф клеточной поверхности. Каждый данный микрорельеф может быть представлен каким-либо одним элементом, или сочетанием различных элементов. На основании характера морфологических образований, входящих в состав данного микрорельефа, можно идентифицировать типы микрорельефа, наблюдаемые у различных клеток в СЭМ. В том случае, когда микрорельеф имеет мономорфный характер, т. е. образован каким-либо одним элементом, его относят к типу, определяемому данным элементом. Таким образом, различают микроворсинчатый, пузырчатый и складчатый типы микрорельефа (см. рис. 37, 38).

При сочетании в микрорельефе различных элементов его относят к смешанному типу: микроворсинчато-пузырчатому, складчато-микроворсинчатому и т. д. (первая часть наименования - по доминирующему элементу) (см. рис. 39, 40, 41).

Морфология внутриклеточных структур

Долгое время на пути исследований внутриклеточных структур с помощью СЭМ стояла проблема "очистки" поверхности органелл при раскалывании клетки. При обычных методах подготовки они оказывались как бы замурованными в гомогенном цитоплазматическом матриксе. Разработка специальных методов позволила путем прямой визуализации подтвердить ранее сформировавшееся представление о трехмерной организации и распределении внутриклеточных органелл. По мере совершенствования способа подготовки образцов для исследования и повышения разрешающей способности СЭМ, сфера его применения в изучении внутриклеточной организации будет постоянно расширяться.

Ядро клетки на сколах выглядит в виде структуры шарообразной или овоидной формы (см. рис. 42). Ядерная оболочка состоит из наружного и внутреннего листков и содержит мелкие отверстия, соответствующие ядерным порам (см. рис. 43, 50). Наружный листок покрыт тесно расположенными гранулами приблизительно одинакового размера, являющимися, по-видимому, прикрепленными к ядерной мембране рибосомами. Кариоплазма на сколах выглядит в виде скоплений гранулярно-фибриллярного материала или пустот (см.рис. 44). Изолированные хромосомы под СЭМ имеют характерную Х-образную форму и состоят из сети фибрилл толщиной 70-100 нм. Ядрышко представляет собой бесформенный конгломерат, соединенный с ядерной оболочкой тяжами хроматина (см. рис. 44).

Эндоплазматическая сеть является органеллой, более эффективно выявляемой с использованием ионного травления. При этом выявляются ламеллярные, тубулярные и везикулярные компоненты эндоплазматической сети (см. рис. 45). Рибосомы и полисомы можно идентифицировать только в СЭМ, имеющем специальную электронную пушку высокого разрешения (см. главу 1).

Пластинчатый комплекс состоит из параллельно расположенных мембранных пластин, заканчивающихся везикулами и вакуолями, и сети тубулярных структур, содержащих гранулы различного диаметра, возможно соответствующих первичным лизосомам.

Митохондрии выглядят в СЭМ в виде шарообразных или палочковидных структур (см. рис. 46). Их очень трудно идентифицировать в том случае, если скол прошел по их наружной мембране. Кристы митохондрий имеют вид тонкой пластинки. Внутреннюю и наружную мембрану митохондрий можно различить только при высокой разрешающей способности СЭМ. Лизосомы, фагосомы и различного рода включения в СЭМ имеют вид овоидных образований.

Метод ионного травления позволяет визуализировать и фибриллярные структуры клетки. Однако для изучения фибриллярных внутриклеточных структур более адекватен метод изучения в СЭМ детергентэкстрагированных препаратов [Караганов Я. Л. и др., 1983]. После удаления с помощью тритона Х-100 мембранных компонентов клетки удается выявить сложную трехмерную организацию компонентов цитоскелета (см. рис. 47, 49). Фибриллярные структуры, расположенные в непосредственной близости от цитоплазматической мембраны, образуют густую трехмерную сеть, называемую цитокортексом (см. рис. 47). В более глубоких зонах клетки цитоскелет состоит в основном из двух типов структур: продольных плотно упакованных пучков, идущих вдоль оси клетки, и мелкопетлистой сети (см. рис. 47). К числу наиболее стабильных к действию детергента участков цитоскелета в эндотелии аорты относятся околоконтактные сети микрофиламентов (см. рис. 48). Длительное детергентное экстрагирование приводит к полному растворению фибриллярных белков, но остаток клеточного ядра сохраняется. В заднем эпителии роговицы, например, оно уплощено, имеет лепешкообразную форму. На поверхности ядра в пластинке гистогенных белков определяются отверстия, соответствующие зонам локального разрежения хроматина в участках расположения комплекса ядерной поры (см. рис. 50).

13. Клетка рака шейки матки человека в условиях культивирования (линия HeLa). Х2400. Видны длинные апикальные и краевые микроворсинки, многие из которых изогнуты.

14. Неопластические эпителиальные клетки почки мыши в условиях культивирования (линия МПТР). Х2800. Видны короткие апикальные и краевые микроворсинки.

15. Клетки асцитной гепатомы Зайдела крысы (многоклеточный агрегат, взвешенный в асцитической жидкости). Х2500. На свободной сферической поверхности клеток видны микроворсинки.

16. Неопластический фибробласт мыши в суспензии (клеткалинии L).X14 000. Ветвящиеся микроворсинки с бульбовидными концевыми расширениями (указаны стрелками).

17. Клетка гепатомы сирийского хомячка в условиях культивирования (линия ГТ 11Б). Х1400. Микроворсинки сосредоточены в центральной части апикальной поверхности клетки.

18. Клетки рака шейки матки человека в условиях культивирования (линия HeLa). X1400. Высокая плотность расположения апикальных микроворсинок.

19. Неопластические фибробласты мыши в условиях культивирования (клетки линии М-22). Х1400. Низкая плотность расположения апикальных микроворсинок.

20. Клетки рака шейки матки человека в условиях культивирования (линия HeLa). Х7000. Краевые микроворсинки участвуют в формировании межклеточного контакта (указано стрелками).

21. Клетка саркомы Юинга человека в условиях культивирования. Х1400. Краевые филоподии (указано стрелками) прикрепляются дистальными концами к поверхности субстрата, на котором расположена клетка.

22. Неопластические фибробласты мыши в условиях культивирования (клетки линии L). Х1400. Дорсальные филоподии (указано стрелками) прикрепляются концами к соседним клеткам.

23. Неопластический фибробласт мыши в условиях культивирования (клетка линии L). Х2800. Начальная стадия процесса распластывания клетки на поверхности твердого субстрата. От основания клетки отходят филоподии (указано стрелками), прикрепляющиеся дистальными концами к субстрату.

24. Эмбриональный фибробласт мыши в условиях культивирования. Начальная стадия процесса ретракции клетки. Х2500. От краев сократившейся клетки отходят ретракционные фибриллы (указано стрелками), дистальные концы которых прикреплены к твердому субстрату в участках, соответствующих расположению клеточного края до начала ретракции.

25. Эмбриональный фибробласт мыши в условиях культивирования. Завершающая стадия процесса ретракции клетки. Х2800. От сильно сократившейся клетки, принявшей сферическую форму, к поверхности субстрата отходят длинные ретракционные фибриллы (указано стрелками).

26. Неопластические фибробласты сирийского хомячка в условиях культивирования (клетки линии ХЭ 239). Х2800. Видна митотическая клетка, принявшая в результате ретракции сферическую форму; от неё радиально отходят длинные ретракционные фибриллы (указано стрелками).

27. Трахеобронхиальпый эпителий мыши. Реснички. Х7000.

28. Эмбриональный фибробласт мыши в условиях культивирования. Начальная стадия процесса распластывания клетки на поверхности твердого субстрата. Х7000. В основании клетки видны ламеллоподии (указано стрелкой) и филоподии (указано двойными стрелками).

29. Эмбриональный фибробласт мыши в условиях культивирования. Клетка в процессе распластывания на поверхности твердого субстрата. Х2800. Вокруг основания клетки видна кольцевидная ламеллоплазма (указано стрелками).

30. Эмбриональный фибробласт мыши в условиях культивирования. Клетка, завершившая процесс распластывания на поверхности твердого субстрата. Х1400. Видна широкая веерообразная ламеллоплазма (Л).

31. Неопластические фибробласты сирийского хомячка в условиях культивирования (клетки линии ХЭТР). Х2800. Краевые раффлы (указаны стрелками).

32. Неопластический фибробласт мыши в условиях культивирования (клетка линии L). Начальная стадия процесса распластывания. Х7000. В основании клетки видны раффлы (указано стрелкой).

33. Клетка саркомы Юинга человека в условиях культивирования. X14000. Видны дорсальные и краевые пузыри (указано стрелками).

34. Клетка асцитной опухоли яичника крысы. X14000. Комбинированные образования "микроворсинка-пузырь" (указано стрелками).

35. Неопластический фибробласт сирийского хомячка в условиях культивирования (клетка линии ХЭТР). Х7000. Комбинированное краевое образование "раффл-микроворсинка" (указано стрелкой).

36. Эмбриональный фибробласт мыши в условиях культивирования. Х2400. Комбинированные краевые образования "ламелло-плазма-раффл" (указано стрелками).

37. Эмбриональный фибробласт мыши в суспензии. Пузырчатый тип микрорельефа. Х6000.

38. Неопластический фибробласт мыши в суспензии (клетка линии L). Микроворсинчатый тип рельефа. Х6000.

39. Неопластический фибробласт мыши в суспензии (клетка линии L). Смешанный тип микрорельефа, состоящего из пузырей и микроворсинок. Х5600.

40. Клетка-аcцитной саркомы мыши в суспензии. Смешанный тип микрорельефа, состоящего из складок (указано стрелкой) и раффлов (указано двойными стрелками). Х6000.

41. Клетка аецитной саркомы мыши в суспензии. Смешанный тип микрорельефа, состоящего из складок (указано стрелками), раффлов (указано двойными стрелками). Х5200.

42. Скол печени крысы. Фиксация гипотоническим раствором осмиевой кислоты. Х7500. Видны клеточные границы, ядра (указано стрелкой) и другие органеллы.

43. Задний эпителий роговицы кролика. Экстракция тритоном Х-100. Х4000. На поверхности ядерных остатков (Я) различимы отверстия ядерных пор и выступающие ядрышки (указано стрелками).

44. Скол печени крысы. Фиксация гипотоническим раствором осмиевой кислоты. Х20 000. В центре виден скол круглого ядра, в котором различимы неправильной формы ядрышко (Яд) и полосы гетерохроматина (ГХ), "подвешивающие" его к кариолемме.

45. Скол печени крысы. Фиксация гипотоническим раствором осмиевой кислоты. Х45000. В верхней части видно скопление цистерн цитоплазматической сети (ЦС), наружная поверхность покрыта гранулярным материалом (рибосомами). В нижней части располагается полусфера ядра (Я) гепатоцита с агрегатами гетерохроматина (ГХ).

46. Скол печени крысы. Фиксация гипотоническим раствором осмиевой кислоты. Х44000. В центре виден поперечный скол митохондрии (MX) с редкими кристами (указано стрелкой). Справа от нее расположены цистерны цитоплазматической сети (ЦС).

47. Эндотелий аорты крысы. Экстрагирование тритоном Х-100. Х11 000. Видна мелкопетлистая сеть микрофиламентов (М.Ф) и выбухающие остатки ядер эндотелиоцтов (Я).

48. Эндотелий аорты крысы. Экстрагирование тритоном Х-100. Х25 000. Видны фибриллярные структуры цитоскелета, расположенные в непосредственной близости от плазмолеммы и образующие густую трехмерную сеть - цитокортекс (ЦК). В околоконтактной зоне пучки микрофибрилл формируют густую околоконтактную сеть (указано стрелками).

49. Эндотелий аорты крысы. Экстрагирование тритоном Х100. Х40000. В цитоскелете различимы индивидуальные микротрубочки и микрофиламенты. Шаровидные структуры (ШС) являются остатками органелл эндотелиальной клетки.

50. Задний эпителий роговицы кролика. X16000. На поверхности лепешкообразного бобовидного остатка ядра видны отверстия ядерных пор (указано стрелками).

ГЛАВА 3. ТКАНИ

Эпителиальная ткань

Эпителии существенно отличаются не только по числу клеточных слоев, форме клеток, наличию процессов ороговения, но и по особенностям рельефа поверхности эпителиоцитов.

По характеру микрорельефа базальной поверхности в эпителиях можно выделить следующие типы клеток: 1) гладкие; 2) микроотростчатые; 3) микроворсинчатые; 4) каемчатые; 5) реснитчатые; 6) микроскладчатые; 7) микролисточковые (покрытые раффлами); 8) смешанные.

Гладкие эпителиоциты составляют большинство клеток в составе эндотелия, выстилающего внутреннюю поверхность крове- и лимфоносного русла, а также заднего эпителия роговицы. Их дорсальная поверхность содержит довольно мало выростов, которые нередко встречаются лишь в зоне межклеточных контактов и выражены нечетко (см. рис. 51, 52).

Микроотростчатые эпителиоциты встречаются в составе эндотелия в зонах повышенных гемодинамических нагрузок, а также в областях декомплексации мезотелия (см. рис. 53). Количество микроотростков на их поверхности довольно значительно, но они не имеют той упорядоченности, какая характерна для микроворсинчатых эпителиоцитов. Микроотростки могут служить своеобразным резервом клеточных мембран. Установлена тесная корреляция между количеством микроотростков и числом микропиноцитозных везикул в клетках. Наши исследования показывают, что микроотростки эндотелиоцитов являются рецепторными зонами клеток. Поверхность гладких и микроворсинчатых эпителиальных клеток является довольно динамичным образованием. Характер микрорельефа клеток существенно меняется в ходе митотического цикла, когда, например, у эндотелиоцитов при их делении на поверхности появляются и быстро исчезают микропузыри (см. рис. 128).

Микроворсинчатые эпителиоциты, как это следует из названия, несут на апикальной поверхности микроворсинки. Они составляют большинство среди клеточных элементов мезотелия (см. рис. 54), кишечного и почечного эпителия. Величина и плотность расположения микроворсинок широко варьируют. Высокие и длинные микроворсинки встречаются в эпителии протока придатка. Они получили название стереоресничек. Однако в отличие от обычных ресничек их опорно-двигательный аппарат состоит из микрофиламентов, а не микротрубочек, и они обладают меньшей двигательной активностью. Плотно расположенные микроворсинки образуют на апикальной поверхности структуру, получившую название щеточной каемки. Эпителиальные клетки, имеющие эту структуру, обозначаются иногда термином "каемчатые".

В мезотелии плотность расположения микроворсинок возрастает в зонах непосредственного соприкосновения и трения листков брюшины. Микроворсинки вместе с гликокаликсом и адсорбированными углеводами и белками формируют своеобразную скользкую прослойку, которая снижает фрикционные повреждения. Короткие микроворсинки обнаруживаются на поверхности клеток эпителия наружной части капсулы клубочка почки (см. рис. 55), маточных труб (см. рис. 56). Короткие и толстые микроворсинки встречаются на апикальной плазмолемме бокаловидных клеток слизистой оболочки кишечника.

Микроворсинки существенно увеличивают площадь клеточной поверхности и тем самым эффективность транспортных процессов, что особенно наглядно проявляется в кишечном и почечном эпителии.

В щеточной (кисточковой) каемке, покрывающей апикальную поверхность кубического эпителия проксимальных извитых канальцев почки, среди густо расположенных рядов микроворсинок определяются округлые цилиндрические западения, где плазмолемма эпителиоцитов не содержит микроворсинок. Это так называемые микрократеры (см. рис. 283). Они, по-видимому, являются специализированными образованиями для реабсорбции белка из первичной мочи.

В некоторых случаях отнесение эпителиальных клеток ко второму или третьему типу клеток вызывает затруднения, например при наличии на их апикальной поверхности коротких и толстых микроворсинок или микроотростков. В этих случаях полезно использование метода просвечивающей электронной микроскопии. Обнаружение расположенных по периферии продольных скоплений микрофибрилл позволяет отнести вырост к категории микроворсинок.

Реснитчатые эпителиоциты встречаются в воздухоносных путях и органах женской половой системы. Реснички эпителиоцитов варьируют по длине и выполняют рецепторную и двигательную функции. Так, в эпителии воздухоносных путей они участвуют в движении слизи с осевшими пылевыми частицами (см. рис. 57), причем реснички согласованно движутся в одном направлении. В эпителии маточных труб движение ресничек способствует прохождению яйцеклетки. Механизм, с помощью которого реснички осуществляют движение, полностью не изучен, но уже ясно, что он связан с деятельностью комплекса микротрубочек, формирующих остов реснички. В некоторых клетках однослойных плоских эпителиев, например в заднем эпителии роговицы, в тонких сегментах петель нефрона почки встречаются одиночные реснички, функциональное значение которых еще неизвестно. Скорее всего они выполняют хеморецепторную функцию.

Однако, как правило, наряду с одиночными ресничками на апикальных поверхностях эпителиоцитов видны микроотростки или короткие микроворсинки.

Микроскладчатые эпителиоциты, как правило, встречаются там, где имеет место сильное абразивное воздействие на эпителий. Они составляют верхние слои клеток многослойных плоских эпителиев роговицы, глотки, пищевода, влагалища (см. рис. 58, 59). Их апикальные поверхности покрыты узкими гребнями и складками. Имея ширину примерно 0,2 мкм, микроскладки возвышаются над поверхностью на 0,4 мкм и расположены на расстоянии приблизительно 0,2 мкм друг от друга. Соединяясь между собой, они формируют мелкие, обычно узкие, заполненные слизью ямочки, что в целом, по-видимому, и помогает удерживать мукоидный слой на клеточной поверхности. Таким образом, эти рельефные образования вместе со слизью выполняют защитную функцию и предохраняют эпителий от абразивного воздействия объектов окружающей среды. Согласно одной из гипотез, микроскладки образуются на базе микроворсинок. В пользу этого предположения свидетельствуют факты обнаружения клеток с переходными типами рельефа, например в сосочковых протоках почки, и сходство диаметров микроворсинки и толщины микроскладок.

Эпителиальные клетки со смешанным типом микрорельефа имеют на своей апикальной поверхности различные категории морфологических образований, например реснички и микроворсинки, микроворсинки и микроскладки и т. д. На многих микроворсинчатых клетках в центре апикальной поверхности располагаются одиночные реснички. В целом клеточная поверхность в дифференцированных эпителиальных клетках с микроворсинчатым, реснитчатым, микроскладчатым и некоторыми смешанными типами микрорельефа - достаточно стабильное и устойчивое образование. В то же время в ходе секреторной деятельности в ряде микроворсинчатых эпителиоцитов, например, в бокаловидных клетках кишечника, призматических эпителиоцитах желчного пузыря, эпителиальных клетках семенных пузырьков, апикальная поверхность плазмолеммы подвергается периодическим изменениям: количество микроворсинок и их длина уменьшаются и формируются возвышения, содержащие секретируемые субстанции. После выброса секрета пузыри спадаются. Большое число клеток в составе многоядерных и многослойных эпителиев не имеют выраженной апикальной плазмолеммы. Например, в многоядерном эпителии слизистой оболочки трахеи и крупных бронхов базальные клетки сужаются к вершине и не достигают просвета.

Латеральные поверхности эндотелиальных клеток, как правило, отличаются повышенной складчатостью. Особенно характерно это для однослойных кубических и призматических эпителиев. Межклеточные контакты однослойных плоских эпителиев хорошо импрегнируются азотнокислым серебром (см. рис. 60, 61). Напротив, латеральная поверхность базальных и вставочных клеток многослойных плоских эпителиев (например, эпидермис кожи) имеет шиловидные цитоплазматические отростки, которые формируют с соответствующими выростами смежных эпителиоцитов десмосомы. Более подробно различные типы эпителиев будут рассмотрены в соответствующих разделах атласа.

Ткани внутренней среды организма

Соединительные ткани

"Человек стар настолько, насколько постарела его соединительная ткань". Этот известный афоризм лаконично и в полной мере определяет значение соединительной ткани организма человека, обусловленное теми многочисленными функциями, которые выполняет соединительная ткань: биомеханическая!, защитная, трофическая и др. Несмотря на значительное разнообразие клеточных и неклеточных элементов, объединенных понятием "соединительная ткань", структурами, оправдывающими это название, являются волокна (коллагеновые и эластические) и основное вещество (интегративно-буферная, метаболическая среда соединительной ткани). Коллагеновые и эластические волокнистые структуры, обладая высокой прочностью, образуют мягкий остов всех органов и анатомических образований организма, т. е. являются своеобразным "скелетом", выполняя, таким образом, биомеханическую функцию. Построенные из фибриллярных белков коллагена и эластина, волокнистые структуры являются достаточно устойчивыми к различным воздействиям процесса препаровки. Именно поэтому они оказались наиболее благоприятным биологическим объектом для СЭ микроскопии.

Волокнистые структуры - наиболее представительный компонент соединительной ткани, имеющий сложную организационную иерархию (табл. 2).

Коллагеновые фибриллы являются одной из основных конструкционных единиц соединительной ткани. Они имеют цилиндрическую форму, спиральную конформацию, длина их неопределенна. Толщина фибрилл варьирует от 20 до 400 нм в зависимости от органной принадлежности соединительной ткани. Толщина каждой отдельной фибриллы также меняется вследствие ее постоянного ветвления, степень которого зависит от органной специфики. Коллагеновые фибриллы могут существовать самостоятельно, образуя волокнистый остов и не объединяясь в волокна, но могут и входить в состав волокон (см. рис. 62). Фибриллы создают поверхностный рельеф коллагеновых волокон. По ходу складок поверхностного рельефа можно видеть особенности расположения фибрилл в волокне. В одних участках фибриллы идут параллельно друг другу и длинной оси волокна, в других - спиралеобразно скручены, иногда расходятся или пересекаются. Поверхность поперечных срезов волокон бугристая, что также подтверждает их внутреннюю фибриллярную структуру. Коллагеновые волокна представляют собой более сложный уровень организации коллагена, являясь фибриллярным комплексом, построенным из коллагеновых фибрилл, которые связаны структурно и находятся в состоянии функционального взаимодействия. Толщина коллагеновых волокон варьирует от 60-400 до 5-20 мкм в зависимости от органной принадлежности и определяется количеством коллагеновых фибрилл, образующих волокна. Оно может колебаться от 2 до нескольких сотен фибрилл. Число последних зависит в свою очередь от биомеханических функций соединительной ткани в составе органа или анатомического образования. Длина коллагеновых волокон неопределенна. До настоящего времени не было обнаружено окончаний коллагеновых волокон. Наблюдается их ветвление на более тонкие волокна или отдельные фибриллы или интеграция последних в более толстые волокна. Степень такого перераспределения также связана с органной спецификой. Все это указывает на структурное единство всего коллагенового каркаса любого органа, и совершенно очевидно, что это единство распространяется на весь волокнистый остов организма.

Таблица 2

Иерархия волокнистых структур

Уровень организации	Элементы структур различных уровней				Методы идентификации
Молекулярный	Молекулярные структуры: коллагеновый белок; эластиновый белок; микрофибриллярный гликопротеид; протеогликаны.				Биохимические Физико-химические
Надмолекулярный	Молекулярные агрегаты: коллагеновые протофибриллы; коллагеновые микрофибриллы; эластические микрофибриллы; эластиновые филаменты.				Трансмиссионная электронная микроскопия (позитивное и негативное контрастирование) Электронная гистохимия
Фибриллярный	Коллагеновые фибриллы Эластические фибриллы				Растровая и трансмиссионная электронная микроскопия
Волоконный	Соединительные волокна				Световая микроскопия (гистология и гистохимия) Растровая электронная микроскопия Трансмиссионная электронная микроскопия
		Качественная характеристика		Конформационная характеристика
		Коллагеновые		Цилиндрические
		Эластические		Уплощенные
		Смешанные (коллагеново-эластическиекие и эластико-коллагеновые)		Плоские
	Тканевый	Соединительный остов				Световая микроскопия (гистология и гистохимия) Растровая электронная микроскопия
		Характеристика по преобладающей структуре	Качественная характеристика			Конструкционная характеристика
		Волоконный	Коллагеновый			Ориентированный
		Волоконно-фибриллярный	Коллагеново-эластический			Неориентированный
		Фибриллярно-микрофибриллярный	Эластико-коллагеновый			Смешанный

Коллагеновые волокна имеют спиральную пространственную конформацию (см. рис. 62-64), в которой чаще всего не соблюдены строгие геометрические пропорции. Тем не менее данные, полученные с помощью СЭ микроскопии, убедительно подтверждают теоретические расчеты спиральности коллагеновых волокон. Необходимо отметить, что даже в пределах какого-либо органа или анатомического образования наблюдаются колебания шага спирали волокна и его амплитуды. Эти вариации в значительной мере зависят от органной специфики, т. е. от характера механических нагрузок, которым подвержен орган. Еще одной важной характеристикой коллагеновых волокон является их форма, которая определяется расположением фибрилл в волокнах. Среди большого разнообразия выделено три основных вида коллагеновых волокон, на основании соотношения длины окружности (Р) и максимального поперечного размера (1). При отношении 0x01 graphic

, находящемся близко к значению 0x01 graphic

, волокна можно называть цилиндрическими; если это отношение приближается к 2, то такое волокно можно назвать плоским, отношение 0x01 graphic

, находящееся в пределах 2,3-3,14, определяет уплощенные волокна. Цилиндрические и уплощенные коллагеновые и эластические волокна составляют основу волокнистых остовов дермы, подкожной жировой клетчатки, выйной связки и др. Из плоских коллагеновых волокон построена роговица и склера, плоские эластические волокна (эластические мембраны) составляют основу эластического каркаса средней оболочки аорты.

В соединительной ткани присутствует еще один волокнистый компонент - эластические волокна, которые имеют физико-химические свойства, отличные от коллагеновых волокон. Поверхность эластических волокон в основном гладкая с изредка встречающимися бугристостями (см. рис. 65, 66). Это дает возможность дифференцировать их от коллагеновых волокон, имеющих, как было указано выше, упорядоченный складчатый рельеф. Однако этот признак во многом зависит от толщины напыляемого слоя углерода или металла во время приготовления образцов к исследованиям в СЭМ.

Для идентификации эластических волокон используется световая или просвечивающая электронная микроскопия. Кроме того, ценная информация о строении коллагеновых и эластических волокон получена с помощью селективного удаления отдельных компонентов соединительной ткани посредством воздействия специфическими ферментами (коллагеназой, эластазой, глюкоамилазой и др.).

Эластические волокна могут взаимодействовать с коллагеновыми и образовывать смешанные волокна. Если в таком волокне преобладает коллагеновая часть, то его называют коллагеново-эластическим, если же большую часть составляет эластический компонент, то такое волокно можно обозначить как эластико-коллагеновое.

Особенно интересная информация была получена с помощью СЭМ при исследовании тканевого уровня организации волокнистых структур. Тканевый уровень организации коллагеновых структур можно определить как волокно-фибриллярный комплекс упорядочение организованных, структурно связанных волокнистых элементов, находящихся в функциональном взаимодействии и подчиненных, в совокупности с другими элементами соединительной ткани, общей функции органа.

Применявшаяся ранее графическая реконструкция волокнистого остова по серийным гистологическим срезам давала весьма приближенную картину, а в отдельных случаях (гиалиновый, эластический хрящи) вообще не могла быть использована.

Применение СЭ микроскопии позволило выделить несколько типов волокнистых остовов. Их конструкционными единицами являются коллагеновые и эластические фибриллы и волокна, а также коллагеновые микрофибриллы. Учитывая соотношение этих волокнистых структур выделены 3 типа волокнистых остовов. В 1-м типе - волоконном, резко преобладают волокна над другими волокнистыми структурами (фибриллами, микрофибриллами). Этот тип встречается в сухожилии, роговице, склере, надхрящнице. В волокно-фибриллярном (2-й тип), наиболее распространенном остове, наблюдается преобладание волокон, но при этом присутствует значительное количество коллагеновых фибрилл, существующих самостоятельно, т. е. не объединенных в волокна (дерма, выйная связка, подкожная жировая клетчатка). Фибриллярно-микрофибриллярный (3-й тип) остов построен главным образом из индивидуально расположенных фибрилл и микрофибрилл, не объединенных в волокна. Изредка встречающиеся волокна состоят из нескольких фибрилл. Такой тип строения характерен для гиалинового хряща (центральная часть). Результаты анализа пространственного взаимоотношения волокнистых структур, т. е. их ориентации в составе остова, позволили выделить 3 типа конструкции. В 1-м, ориентированном, типе основная масса волокнистых структур располагается вдоль одной из осей органа (сухожилия, связки), т. е. ориентируется вдоль линии напряжения, связанной с механическими нагрузками (см. рис. 68, 69). Во 2-м, неориентированном, типе строения волокнистые элементы располагаются без определенной геометрической закономерности (см. рис. 67). Такой остов обладает свойством механической изотропности в противоположность анизотропии ориентированного типа. Неориентированный тип остова имеет дерма, гиалиновый хрящ (см. рис. 70, 71). В волокнистых остовах, где наблюдается сочетание вышеуказанных двух типов строения, выделен смешанный (3-й тип) тип конструкции, характерный для надхрящницы, роговицы, склеры (см. рис. 72-84).

Учитывая величину межволокнистых пространств, в одном случае можно говорить о плотной волокнистой соединительной ткани (выйная связка, надкостница, склера и т. д.), в другом - с рыхлой (подкожная жировая клетчатка, дерма).

Переход волокон из остова одного органа в другой с различными конструкциями, связанными с их биомеханической функцией, происходит с определенной трансформацией (см. рис. 85). Между различными смежными конструкциями существует переходный остов, который является основой рыхлой соединительной ткани. Этот остов имеет неориентированный тип строения, относительно большие межволокнистые пространства, выраженную спиральность волокон цилиндрической формы. Такие особенности строения позволяют ему выполнять своеобразную редукторную функцию между соседними органами с различной механической подвижностью.

СЭ микроскопия позволила сформулировать ряд общих закономерностей структурной организации волокнистых элементов, объединенных основным веществом в целый функциональный комплекс. К таковым относятся: а) наличие 5 уровней организации (молекулярный, надмолекулярный, фибриллярный, волокнистый, тканевый); б) структурные связи между элементами одного уровня носят поперечный локальный характер и поддерживают его определенную организацию. На большем протяжении элементы уровня разделены промежутками, размеры которых находятся в соответствии с размерами волокнистых элементов данного уровня. Эти промежутки заполнены метаболической, интегративно-буферной средой (основным веществом), главными компонентами которой являются структурированные протеогликаны и вода; в) все волокнистые элементы имеют спиральную конформацию, а также суперспиральность, определяемую более высоким уровнем организации, в состав которого они входят; г) на всех уровнях организации происходит перераспределение элементов их внутреннего состава (ветвление или слияние).

Результаты проведенного сравнительного анализа архитектоники волокнистой стромы исследованных органов позволили выявить органные особенности, проявляющиеся в степени выраженности (развития) тех или иных общих закономерностей строения и их определенного сочетания, характерного для данного органа.

С помощью СЭ микроскопии получены также новые сведения о пространственной организации соединительнотканных клеточных элементов. Форма клеток, их пространственное взаимоотношение, особенности поверхностного рельефа клеточных оболочек, определяемых в СЭМ, дают возможность проводить детальный анализ и дифференцировать соединительнотканные элементы (см. рис. 86).

Жировая ткань

В организме млекопитающих встречаются два основных вида жировой ткани: белая и бурая. Отличительной особенностью белой жировой ткани является то, что в зрелом состоянии она состоит из агрегатов клеток с одной жировой каплей, заполняющей весь объем клетки. При плотной упаковке, когда одна клетка как бы сдавливает соседние, жировые клетки приобретают полигональную форму (см. рис. 87). В бурой жировой ткани клетки содержат не одну, а несколько жировых капель.

Жировая клетка покрыта снаружи тонкой пластинкой филаментозной природы, сформированной несколькими слоями тонких анастомозирующих ретикулярных волокон. Более толстые волокна являются, по-видимому, коллагеновыми (см. рис. 87). На поперечных сколах жировая ткань выглядит в виде своеобразных сот. Содержимое клеток вымывается в процессе проводки, и каждая сота представляет собой клетку с удаленной жировой каплей. Внутри клетки иногда определяется выбухание, соответствующее зоне расположения уплощенного клеточного ядра (см. рис. 88).

Помимо скоплений жировых клеток в виде жировой ткани, в организме встречаются единично расположенные жиросодержащие клетки. Примером может служить вокругсинусоидный липоцит печени (см. рис. 88). В этих клетках много мелких жировых капелек, заполняющих всю цитоплазму клетки.

Кровь

Эритроциты. В нормальных условиях эритроцит, фиксированный в суспензии, имеет форму двояковогнутого диска (дискоцит). Его поверхность в СЭМ (с разрешающей способностью порядка 5-7 нм) выглядит сглаженной: на ней не выявляются какие-либо рельефные образования (см. рис. 89).

В результате разного рода воздействий форма эритроцитов легко изменяется: возникают деформированные клетки с множественными пальцеобразными выростами на поверхности (эхиноциты), сферические эритроциты с гладкой поверхностью или с выростами, клетки куполообразной или кольцевидной формы (см. рис. 90). Так, например, превращение дискоцитов в эхиноциты и сферические клетки наблюдается при длительном хранении цитратной крови (в течение нескольких недель при температуре 2-6®С), при помещении эритроцитов в несвежую плазму крови, наличии в сыворотке или плазме агглютинирующих антител, повторном промывании эритроцитов физиологическим раствором, их гипотонической фиксации и других воздействиях.

Вследствие такой высокой реактивности эритроцитов их подготовка к СЭ микроскопии требует особой тщательности. Это требование усугубляется тем, что указанные выше видоизмененные формы эритроцитов могут наблюдаться также при целом ряде патологических состояний: хронической ишемической болезни сердца, врожденных или приобретенных гемолитических заболеваниях и др.

Лейкоциты. Лейкоциты относятся к клеткам, характеризующимся особенно высокой реактивностью поверхности, рельеф которой может претерпевать серьезные изменения в результате методических погрешностей, допущенных в процессе подготовки препарата к СЭ микроскопии.

Гепаринизированную кровь можно фиксировать целиком; чаще, однако, ее вначале разделяют на клеточные фракции, сперва отделяя основную массу эритроцитов, а затем получая раздельные субпопуляции лейкоцитов. Предфиксационная обработка должна быть быстрой и проводиться при температуре 37 ®С. Пониженная температура (4®С) вызывает обратимые изменения рельефа поверхности лейкоцитов. Необходимо также до фиксации избегать контактов клеток с какими-либо твердыми поверхностями. Применение методик, предусматривающих предварительное (перед фиксацией) осаждение живых лейкоцитов на разного рода подложки - миллипоровые серебряные фильтры, покрытия из полилизина, показало, что даже кратковременные контакты с подложкой могут вызвать значительные изменения в микрорельефе клеточной поверхности. Отсюда следует, что для сохранения прижизненной морфологии поверхности лейкоцитов их следует фиксировать во взвеси. При этом, однако, возникают методические трудности, связанные с необходимостью прикрепления фиксированных клеток к какой-нибудь подложке для последующей обработки.

Между тем фиксированные во взвеси клетки весьма слабо прикрепляются к большинству твердых поверхностей. Это преодолевается с помощью специальных подложек-ловушек. Изготовление многих из них, однако, довольно трудоемко. Использование некоторых подложек-ловушек может вызвать повреждение поверхности фиксированных лейкоцитов. Простой и весьма эффективной подложкой-ловушкой может служить алюминиевая фольга [Ровенский Ю. А., 1979].

Идентификация с помощью СЭМ отдельных типов лейкоцитов в смешанных популяциях клеток крови осуществляется с помощью комбинированного метода: световая микроскопия - СЭ микроскопия. Для этого готовят влажные окрашенные препараты, в которых при световой микроскопии идентифицируют отдельные типы лейкоцитов и маркируют их локализацию в препарате. После этого препарат (не допускать высыхания) готовят для СЭ микроскопии.

Лимфоциты. Обладают почти идеальной сферической формой (при фиксации во взвеси). Если средний диаметр фиксированных лимфоцитов человека составляет 7,9 мкм, то у лимфоцитов, подвергшихся замораживанию - высушиванию, диаметр уменьшается до 6,8 мкм, а у лимфоцитов, высушенных методом перехода критической точки, - до 5,5 и менее (эффект сжатия).

Характерными морфологическими образованиями поверхности лимфоцита являются микроворсинки. Их число и размеры могут значительно варьировать. В некоторых случаях уменьшение плотности расположения микроворсинок на поверхности лимфоцита является кажущимся и связано с укорочением этих образований. Располагаются микроворсинки относительно равномерно.

На основании оценки количества микроворсинок на доступной наблюдению сферической поверхности клетки (1/2 всей ее поверхности) лимфоциты разделяют на 3 группы: микроворсинчатые (см. рис. 91, 93), умеренно микроворсинчатые и сглаженные (см. рис. 92). У человека к микроворсинчатым относят лимфоциты с числом микроворсинок на поверхности, доступной наблюдению, выше 80; длина микроворсинок колеблется от 0.2 до 1 мкм, но иногда может достигать 2 мкм. К умеренно микроворсинчатым относят лимфоциты с числом наблюдаемых микроворсинок не более 40-70; микроворсинки в большинстве своем очень короткие. Сглаженные лимфоциты человека характеризуются очень небольшим (менее 40) числом наблюдаемых микроворсинок; последние чаще всего настолько коротки (менее 0,5 мкм), что по виду приближаются к микропузырям.

Одно время высказывалось утверждение, что лимфоциты, относящиеся к микроворсинчатым или умеренно микроворсинчатым, являются В-лимфоцитами, а сглаженные - Т-лимфоцита-ми. Это утверждение основывалось на сопоставлении данных СЭ микроскопии с данными иммунологической идентификации В- и Т-лимфоцитов. Однако выяснилось, что в то время, как соотношение числа Т- и В-лимфоцитов крови человека, определяемое иммунологическими методами, остается постоянным, соотношение количества лимфоцитов с относительно сглаженной и микроворсинчатой поверхностью, выявляемой в СЭМ. может значительно варьировать в зависимости от методических особенностей процесса подготовки клеток (см. выше). Очевидно, что идентификация Т- и В-лимфоцитов с помощью только СЭМ недостаточна: она всегда должна сопровождаться иммунологическими методами тестирования.

В отличие от лимфоцитов гранулоциты не имеют правильной сферической формы: один полюс клетки слегка вытянут в виде множественных коротких раффлов (см. главу 2). Если нейтрофил сохраняет сферическую форму, то его поверхность имеет складчатый микрорельеф с короткими раффлами. В микрорельефе поверхности эозинофилов преобладают мелкие складки.

Гранулоциты легко прикрепляются к различным твердым поверхностям; при этом наблюдаются быстрые и значительные изменения как формы клеток, так и микрорельефа их поверхности.

Моноциты крови при их фиксации во взвеси имеют форму, близкую к сферической. Диаметр клеток колеблется от 4,9 до 7,1 мкм. Моноциты обладают микрорельефом, состоящим из крупных складок и раффлов. На поверхности некоторых моноцитов могут также встречаться небольшие микроворсинки. Сходной морфологией клеточной поверхности обладают тканевые макрофаги.

Тромбоциты. Как и другие клетки крови, тромбоциты отличаются высокой реактивностью. Состояние активации, резко изменяющее морфологию клетки и ее поверхности, могут вызывать контактные взаимодействия тромбоцитов с твердыми поверхностями, а также химические агенты. Доказано, что при фиксации крови немедленно после извлечения из вены лишь 40-70% тромбоцитов не имеют признаков активации. Эти клетки дисковидной или овальной формы, имеют ровные контуры и относительно сглаженную поверхность с изредка встречающимися ямкообразными углублениями. Остальные тромбоциты активированы (см. рис. 94): у них на периферии обнаруживаются по 1-2 коротких отростка (встречаются также клетки с множественными длинными отростками); иногда наблюдаются 2-3-клеточные агрегаты. Активация в данном случае, возможно, обусловлена контактными взаимодействиями тромбоцитов в сосудистом русле с другими форменными элементами крови или эндотелием, а также активирующими веществами в крови. Тромбоциты, прилипшие к деэндотелизированной стенке сосуда, вначале образуют множество отростков, а затем распластываются (см. рис. 95).

Мышечная ткань

Скелетная поперечнополосатая (исчерченная) мышечная ткань состоит из отдельных мышечных волокон, окруженных прослойками рыхлой волокнистой соединительной ткани. В СЭМ индивидуальные мышечные волокна благодаря пластинкам эндомизия выглядят как плотно прилежащие друг к другу поперечносколотые цилиндры (см. рис. 96, 97, 98). Каждое мышечное волокно покрыто гладкой сарколеммой, вокруг которой располагается пластинка базальной мембраны. На поверхности сарколеммы имеются небольшие отверстия, являющиеся местом выхода поперечных трубочек. Поверхность сарколеммы имеет циркулярные строго регулярно расположенные вдавления и возвышения, соответствующие поперечной исчерченности миофибриллярного аппарата (см. рис. 96, 97). Вдоль волокна на поверхности сарколеммы через определенное расстояние встречаются овальные возвышения, соответствующие ядрам мышечных клеток. Под сарколеммой имеется тонкий ободок саркоплазмы, имеющий сетчатое строение.

Большая часть объема мышечного волокна занята длинными тонкими пучками миофибрилл, протягивающимися от одного конца клетки к другому и имеющими различную толщину. Между фибриллами расположены небольшие по объему межфибриллярные пространства. Вдоль пучков лежат ряды митохондрий овальной формы, длиной до 2 мкм (см. рис. 99). Пучки миофибрилл представляют собой круглые канатообразные структуры с правильным чередованием утолщенных (Z-линии) и утонченных (I-линии) участков (см. рис. 80). В зоне утонченных участков видны парные пузыревидные структуры - гребешки, окружающие пучок и являющиеся двумя терминальными цистернами саркоплазматического ретикулума. Участок от одного углубления между терминальными цистернами до другого соответствует саркомеру и имеет в длину 2 мкм (см. рис. 100, 101).

Сетчатые и трубчатые элементы саркоплазматического ретикулума при препаровке обычно разрываются и его растянутые мешочки видны не полностью (см. рис. 100). Центральная часть ретикулума представляет собой ветвящуюся систему цистерн, прилежащих к миофибриллам. Трубочки саркоплазматического ретикулума соединяют группы митохондрий.

Микрососудистая система мышц представлена сплетениями, состоящими из продольно ориентированных капилляров. Последние характеризуются резко извитым ходом. Расстояние между индивидуальными микрососудами приблизительно равно диаметру индивидуального мышечного волокна. Поперечные капилляры, окружающие миоциты, служат для связи между длинными извитыми капиллярами. Извитость продольных капилляров связана с сократительной функцией мышцы. Нервные терминали заканчиваются на мышечных волокнах нейромышечными синапсами (см. рис. 102, 103, 104).

Сердечная поперечнополосатая (исчерченная) мышечная ткань, в отличие от скелетной, представлена главным образом одноядерными кардиомиоцитами, которые, анастомозируя друг с другом, формируют трехмерную сеть (см. рис. 105, 106). Ядра чаще располагаются в центре мышечных клеток. Большая часть объема кардиомиоцита занята миофибриллами. Митохондрий в сердечных мышечных волокнах значительно больше, чем в скелетных, однако саркоплазматический ретикулум развит не так сильно. Строение микроциркуляторного русла во многом аналогично таковому в скелетных мышцах. Отмечается продольная ориентация капилляров, в то время как артериолы и венулы идут косо по отношению к общему направлению расположения анастомозирующих кардиомиоцитов (см. рис. 107).

Гладкомышечная (неисчерченная) ткань образована миоцитами, которые обычно имеют удлиненную веретенообразную, многоотростчатую или звездчатую форму. На плазмолемме часто обнаруживаются продольные или косые складки. Гладкомышечные клетки нередко соединяются друг с другом с помощью цилиндрических отростков.

Нервная ткань

СЭМ в нейроморфологии прежде всего была использована для исследования свободных поверхностей мозга: оболочек, сосудистого сплетения, желудочков, т. е. участков, наиболее доступных для изучения (см. рис. 109-113). При этом была обнаружена неоднородность строения эпендимной выстилки желудочков, отличия в развитии и строении эпендимы в местах локализации так называемых циркумвентрикулярных органов, участвующих, по-видимому, в регуляции водно-солевого обмена, а также прямой контакт некоторых нервных клеток в этих областях с ликвором [Allen D. J. et al., 1981].

Полезным оказалось применение СЭМ для изучения клеточных взаимоотношений в процессе развития ЦНС. Используя технику замораживания - скалывания или применяя фиксацию, вызывающую повышенное уплотнение ткани, и изучая паренхиматозные участки на разломах, разрывах и разрезах, удалось проследить динамику развития топографических взаимоотношений клеток, начиная со стадии формирования нервной трубки до стадии морфологически дефинитивного мозга. При развитии наблюдается постепенное уплотнение паренхимы мозга и отчетливо прослеживается колончатое расположение клеток.

При изучении периферической нервной системы применение СЭ микроскопии позволяет после удаления эпи- и периневрия наблюдать миелиновые оболочки аксонов с границами отдельных шванновских клеток (леммоцитов), на аксоне - перехваты Ранвье, а также места неравномерной намотки миелина- насечки Шмидта - Лантермана. СЭ микроскопия оказала также существенную помощь в анализе пространственной организации процессов дегенерации и регенерации нервов, уже давно интенсивно изучаемых разными методами, а также в выявлении быстрых процессов, возникающих при распаде миелина и регенерации поврежденного нерва. В случаях применения специальных методов обработки тканей СЭМ позволяет визуализировать нервные окончания. Так, при обработке мышечной ткани 8N НС1 растворяются рыхлые коллагеновые и эластические волокна, что позволяет наблюдать аксомышечный синапс или моторную бляшку (см. рис. 102).

Новые возможности в изучении нервной ткани дает применение СЭМ для исследования нервной ткани in vitro. Культивирование ткани вне организма в настоящее время широко применяется в изучении структур и свойств нервной системы. Нервная ткань может существовать in vitro в виде так называемых организованных культур, представляющих собой эксплантаты с зоной роста вокруг них, диссоциированных клеток, или в виде подвергшихся неопластической трансформации "бессмертных" клеточных линий. Эти модели подходят для получения информации о клеточных элементах нервной системы и факторах, влияющих на их состояние, которую трудно получить другим способом. В культуре ткани могут восстанавливаться нейронные сети, имеющие, однако, более простое строение, чем в организме. Важным преимуществом культуры ткани может быть возможность создания контролируемых условий.

С помощью СЭМ в культуре нервной ткани удалось наблюдать морфологические проявления регенерации и роста аксонов, особенности миграции клеток из эксплантата, пространственные отношения между нейронами и глиальными элементами, возникновение первичных клеточных контактов. При этом была детально изучена поверхностная морфология клеточных элементов (см. рис. 114-120). Исследование нервной ткани в культуре позволило определить генетически запрограммированную норму реакции поверхности клеток при отсутствии большинства внешних воздействий. В то же время СЭМ оказался особенно полезным при изучении ответа плазматической мембраны нервных клеток на биологически активные вещества. Быстро протекающие поверхностные изменения клеточных мембран были прослежены, например, при действии нейроростового фактора на мембранные рецепторы симпатических нейронов.

Ряд процессов был проанализирован с помощью СЭ микроскопии на перевиваемых опухолевых клеточных линиях нейрогенного происхождения, сохраняющих ряд признаков и некоторые биохимические особенности, свойственные нормальному клеточному прототипу. Так, относительно малоподвижные гладкие клетки нейробластомы немедленно реагировали на бычьи ганглиозиды образованием микроворсинок и пузырей.

51. Задний эпителий роговицы человека. X1300. Однослойный плоский эпителий. Видны хорошо выраженные маргинальные складки, единичные микроворсинки и реснички (указано стрелкой). Ядерные выбухания (указано двойной стрелкой) овальной формы расположены эксцентрично.

52. Задний эпителий роговицы крысы. Х4400. Однослойный плоский эпителий. Видны маргинальные складки (указано двойной стрелкой) и короткие микроотростки (указано стрелками).

53. Мезотелий плевры обезьяны в зоне декомплексации. Х2300. Однослойный плоский эпителий. На апикальной поверхности мезотелиоцитов видно множество микроотростков. Межклеточные контакты в зоне декомплексации расширены, образуются сквозные отверстия ("стоматы"). Зона декомплексации окружена поясом клеток, практически не имеющих микроотростков на поверхности.

54. Мезотелий брюшины, покрывающий печень крысы. Х5000. На поверхности клеток заметны множественные микроворсинки, приобретающие над ядросодержащим возвышением характер микроотростков.

55. Эпителий наружной части капсулы нефрона почки крысы. Х4000. Однослойный плоский эпителий. Короткие микроворсинки встречаются редко, они концентрируются в основном в зоне межклеточных контактов. Имеются единичные реснички (указано стрелками).

56. Эпителий маточных труб крысы. Х4000. Однослойный цилиндрический эпителий. Большинство клеток имеет на апикальной поверхности короткие микроворсинки, чаще располагающиеся ближе к межклеточным границам. Внизу слева расположен реснитчатый эпителиоцит (РЭ).

57. Эпителиальная выстилка слизистой внутрилегочного бронха ребенка. Х1500 (препарат Л. К. Романовой). Мерцательный эпителий. Поля реснитчатых клеток чередуются с островками нереснитчатых. Реснички рядом расположенных клеток изогнуты в одном направлении. Волнообразные синхронные движения ресничек обеспечивают мукоцилиарный транспорт.

58. Передний эпителий роговицы кролика. Х9200. Многослойный плоский неороговевающий эпителий. На поверхности клеток видны своеобразно изогнутые мелкие микроворсинки и микроскладки. Граница между эндотелиоцитами (указано стрелками) имеет вид углубления между выростами поверхности клеток.

59. Эпителий пищевода крысы. X 10000. Многослойный плоский неороговевающий эпителий. На поверхности эпителиоцитов заметны причудливо анастомозирующие микроскладки. Видно скопление бактерий (Б), обитающих на поверхности эпителия пищевода.

60. Мезотелий брюшины крысы. Х3300. Однослойный плоский эпителий. Апикальная поверхность клеток покрыта многочисленными микроворсинками. Видны границы мезотелиоцитов.

61. Эпителий париетального листка капсулы нефрона крысы. Х5000. Однослойный плоский эпителий. Микроворсинки немногочисленны, сконцентрированы в основном в зоне межклеточных контактов. Видны расположенные эксцентрично реснички (указано стрелками).

62. Дерма кожи человека. Х5000. Цилиндрические коллагеновые волокна (KB) спиральной формы. Поверхностный складчатый рельеф образован коллагеновыми фибриллами, входящими в состав волокон и расположенными вдоль их длинной оси. Коллагеновые волокна на поперечном срезе (указано стрелкой) имеют бугристую поверхность, что указывает на фибриллярную структуру волокон. Вставка: коллагеновые фибриллы имеют характерную периодическую исчерченность. Представлены фрагменты четырех коллагеновых волокон. Х50000.

63. Адвентиция аорты человека. Х3800. Уплощенное коллагеновое волокно (KB) спиральной формы. Специфическая" конформация поддерживается системой тонких поперечно расположенных волоконец, образующих специальную систему.

64. Соединительнотканная оболочка глаза человека. Участок перехода роговицы в склеру. Х3800. Плоские коллагеновые волокна (KB) имеют некоторую спиральность. Они разделены между собой промежутками. Волокна располагаются параллельно друг другу одно над другим.

65. Эластический хрящ ушной раковины человека. Х1600. В центре видны ветвящиеся эластические волокна цилиндрической формы (ЭВ). Эластические волокна различного диаметра переплетаются с отдельными коллагеновыми фибриллами (КФ) и волокнами (KB). Поверхность эластических волокон гладкая, что отличает их от коллагеновых волокон, имеющих продольную складчатость.

66. Средняя оболочка аорты человека. Х1600. Построена из концентрически расположенных фенестрированных (окончатых) эластических мембран, состоящих из эластических волокон.

67. Дерма кожи человека. Сетчатый слой. Х1600. Цилиндрические коллагеновые (KB) и эластические волокна (ЭВ) спиральной формы не упорядочены по отношению друг к другу. Взаимосвязь волокон поддерживается системой тонких волокон. Волокнистый остов характеризуется как коллагеново-эластический, волоконо-фибриллярный, неориентированный.

68. Ахиллово сухожилие человека. Х1600. Фрагмент волокнистого остова. Основная часть коллагеновых волокон ориентирована параллельно длинной оси сухожилия. Между волокнами имеются небольшие промежутки.

69. Ахиллово сухожилие человека. Х5000. Волокнистый остов - коллагеновый, волоконный, ориентированный. Основу волокнистого остова сухожилия составляют коллагеновые волокна (KB), большинство из которых ориентированы параллельно длинной оси сухожилия. Другая система тонких коллагеновых волокон (ТВ) расположена поперечно длинной оси сухожилия. Одна часть тонких волокон располагается на поверхности основных коллагеновых волокон, другая - пронизывает их. Связочные волокна (СВ) разветвляются и, пересекая друг друга, образуют густые сплетения, располагаясь на поверхности основных коллагеновых волокон.

70. Гиалиновый хрящ носовой перегородки человека. X15000. Волокнистый остов построен главным образом из коллагеновых фибрилл (КФ), не объединенных в волокна. Фибриллы располагаются неориентированно, без определенной геометрической закономерности.

71. Гиалиновый хрящ носовой перегородки человека. Хондроцит в лакуне. X10000. Поверхность клетки имеет бугристый рельеф. Многочисленные отростки (О) контактируют со стенкой лакуны, фиксируя положение клетки. Стенки лакуны построены из коллагеновых фибрилл (КФ).

72. Пульпозное ядро межпозвонкового диска человека. Х1600. Волокнистый остов пульпозного ядра состоит из тонких коллагеновых фибрилл, не объединенных в волокна. Фибриллы располагаются редко и лишь в отдельных местах образуют сплетения.

73. Малоберцовая кость человека. Х1600 (препарат Л. А. Деева). 1 - наружный слой надкостницы; 2 - внутренний слой надкостницы; 3 - компактное вещество кости.

74. Малоберцовая кость человека. Эпифиз. Губчатое вещество. Х1600
(препарат Л. А. Деева).

75. Сосуд в надкостнице малоберцовой кости человека и его связь с окружающими тканями. Х1600 (препарат Л. А. Деева).

76. Малоберцовая кость человека. Срез, перпендикулярный длинной оси кости. Х300. Структурная единица кости (остеон) построена из циркулярно расположенных вокруг центрального канала костных пластинок (плоских коллагеновых волокон). Между остеонами находятся вставочные пластинки - остатки ранее существующих остеонов.

77. Малоберцовая кость человека. Срез, продольный диафизу кости. хЗОО. Видна внутренняя поверхность центрального канала.

78. Малоберцовая кость человека. Срез остеона вдоль центрального (гаверсова) канала. Х600. Виден микрорельеф внутренней поверхности канала. Наблюдается чередование костных пластинок; коллагеновые фибриллы в них направлены параллельно и поперечно длинной оси центрального канала.

79. Малоберцовая кость человека. Угловой срез остеона. Х600. Видно взаиморасположение костных пластинок, построенных из тонких фибриллярных элементов - коллагеновых фибрилл.

80. Роговица глаза человека. Срез, перпендикулярный поверхности роговицы. Х150. Волокнистый остов построен из плоских коллагеновых волокон спиральной формы, в основном ориентированных параллельно поверхности роговицы. В межволоконных пространствах в нативном состоянии находится гелеподобное основное вещество, определяющее оптические свойства роговицы.

81. Роговица глаза человека. Срез, перпендикулярный поверхности роговицы. Х1600. Видны плоские коллагеновые волокна ламинарной формы с относительно большими пространствами между ними.

82. Роговица глаза человека. Тангенциальный срез. Х1600. Виден переход одного плоского коллагенового волокна в другое.

83. Склера человека. Срез, перпендикулярный поверхности склеры. Х1600. Плоские коллагеновые волокна плотно прилежат друг к другу, их спиральность почти не выражена. Межволоконные промежутки не выявляются.

84. Склера человека. Тангенциальный срез. Х1600. Волокна располагаются параллельно друг другу. Четко проявляется поверхностный рельеф коллагеновых волокон.

85. Обобщенная схема взаимосвязей, переходов и конструкционной трансформации волокнистых элементов и остовов.

1 - коллагеново-эластический, волоконно-фибриллярный, неориентированный тип остова (рыхлая соединительная ткань); 2 - коллагеновый, волоконный, ориентированный тип остова (сухожилие); 3 - коллагеновый, волоконный, смешанный тип конструкции (роговица); 4 - коллагеновый, фибриллярно-микрофибриллярный неориентированный тип остова (гиалиновый хрящ); 5 - эластико-коллагеновый, волоконно-фибриллярный, смешанный тип остова (средняя оболочка аорты).

86. Тканевой базофил из перитонеальной жидкости крысы в стадии детрануляции. X14 900 (препарат Н. М. Сидорова, А. А. Миронова, В. А. Миронова). На поверхности клетки расположено множество секреторных гранул.

87. Жировые клетки брыжейки крысы. Х1000. Тела клеток имеют куполообразную форму, покрыты сетью прямых и извитых соединительнотканных волокон.

88. Жировые клетки брыжейки крысы. Скол проходит через тела клеток. X1770. В процессе обезвоживания жир удален и жировые клетки приобрели вид сот, стенки которых образованы прилежащими друг к другу плазмолеммами и цитоплазматическими ободками.

89. Эритроцит человека. Нормальная форма (дискоцит). X10000.

90. Эритроциты человека. Видоизмененные формы: эхиноциты (указаны стрелками), сфероцит с выростами (указано двойной стрелкой). Х3200 (препарат И. Ш. Нижарадзе).

91. Лимфоцит крови человека. "Микроворсинчатый" тип. X14000.

92. Лимфоцит крови человека. "Сглаженный" тип. X14000.

93. "Розетка"-лимфоцит крови человека в контакте с эритроцитами барана. Х7000.

94. Тромбоциты человека: неактивированные (указано стрелкой) и активированные (указано двойными стрелками) формы. Х7000 (препарат А. Ю. Александровой).

95. Тромбоциты крысы, прилипшие к стенке аорты в зоне повреждения эндотелиального слоя. X1600 (препарат А. А. Миронова, В. А. Миронова). Большая часть тромбоцитов активирована; имеет несколько микроотростков. В левом нижнем углу виден участок подэндотелиального слоя, не покрытый тромбоцитами.

96. Мышечные волокна диафрагмы крысы. Экстрагирование фиксированного образца с помощью теплого 8N раствора соляной кислоты. Х1500. Видна наружная поверхность двух мышечных волокон. Прослеживаются регулярные поперечные полоски и ядросодержащие возвышения (Я).

97. Слой соединительной ткани эндомизия на поверхности мышечных волокон четырехглавой мышцы бедра человека. Х6400 (препарат Ю. А. Хорошкова). Вверху видны участки мышечных волокон, лишенные эндомизия.

98. Фибриллы, обеспечивающие взаимосвязь коллагеновых волокон с сарколеммой. Четырехглавая мышца бедра человека. Х87 000 (препарат Ю. А. Хорошкова).

99. Скол поперечнополосатого мышечного волокна диафрагмы крысы. Х5000. Видны соединительнотканные волокна эндомизия. Внутри волокна отчетливо выявляется поперечная исчерченность.

100. Два поперечно сколотых мышечных волокна диафрагмы крысы. Х3000. Видно, что волокно имеет цилиндрическую форму. На сколе мышечного волокна отчетливо видно, что его структурной единицей являются саркомеры.

101. Скол мышечного волокна диафрагмы крысы. X12 500. Видны саркомеры и дистерны саркоплазматического ретикулума (указано стрелкой).

102. Терминали коллагенового волокна, оканчивающиеся на сарколемме. Четырехглавая мышца бедра человека. Х4500 (препарат Ю. А. Хорошкова).

103. Кровеносные капилляры, оплетающие мышечное волокно диафрагмы крысы. Экстрагирование фиксированной ткани с помощью теплого 8N раствора соляной кислоты. Х6500.

104. Микрососуды двуглавой мышцы крысы. Х300. Коррозионный препарат. Густая сеть кровеносных капилляров ориентирована по ходу миоцитов. Большинство микрососудов имеют скрученную форму вследствие сокращения мышцы во время введения инъекционной массы.

105. Продольный срез стенки левого желудочка сердца крысы по ходу левой венечной артерии. Х100. Видны мышечные волокна, ориентированные в различных направлениях и образующие густую пространственную сеть. В сердечной мышечной ткани практически нет выраженных соединительнотканных прослоек. Они образуют лишь наружную оболочку кровеносных сосудов, проникающих в мышечную ткань.

106. Косой скол стенки левого желудочка сердца крысы. X1000. Кардиомиоциты связаны друг с другом и образуют сеть, в которой заметны просветы кровеносных капилляров (указано стрелками).

107. Мышечная ткань левого желудочка сердца крысы. Х300. Коррозионный препарат. Капилляры ориентированы по ходу мышечных волокон; между продольными микрососудами много поперечных анастомозов. В центре видно начало венулы (указано стрелкой).

108. Участок коры больших полушарий мозга крысы на разломе. Х2580. Видно переплетение отростков нервных и глиальных элементов мозга (нейропиль), в котором лежат тела клеток (ТК).

109. Мягкая мозговая оболочка, покрывающая наружную поверхность мозга крысы. Х2900. Под слоем эпителиальных клеток видны очертания сосудов (С).

110. Поверхность бокового желудочка мозга крысы. X1170. Видна выстилающая поверхность желудочка эпендима с пучками ресничек.

111. Эпендима бокового желудочка мозга крысы. X2020. Видна апикальная поверхность клеток кубического эпителия эпендимы, покрытая ресничками и низкими микроворсинками.

112. Сосудистое сплетение мозга крысы, секретирующее цереброспинальную жидкость. Х234. Видна сеть кровеносных капилляров, покрытых снаружи кубическим эпителием.

113. Участок поверхности сосудистого сплетения мозга крысы. Х1800. Видны клетки кубического эпителия (КЭ), покрытые микроворсинками и в отличие от клеток эпендимы не имеющие на своей поверхности ресничек.

114. Эпендима бокового желудочка мозга новорожденной крысы в первичной культуре (24 дня). Х5200. Участок густого реснитчатого покрова.

115. Эпендима бокового желудочка мозга новорожденной крысы в первичной культуре. Х3600. Между клетками кубического эпителия видны четкие границы. Апикальная поверхность разных клеток отличается по степени развития микроворсинок. Некоторые клетки формируют реснички (Р).

116. Кора больших полушарий мозга крысы в первичной культуре (6 дней). Х2400. Видно выселение из эксплантата (Э) глиальных клеток (ГК) и аксонов, которые часто объединяются в пучки (указано стрелками).

117. Зона роста вокруг эксплантата коры больших полушарий мозга крысы в первичной культуре (5 дней). Х4600 (препарат А. С. Халанского, И. В. Викторова) Видны растущие аксоны (указано стрелками), сопровождающие их олигодендроциты (О), ориентированные вдоль отростков, и распластывающиеся астроциты (А).

118. Кора больших полушарий мозга крысы в первичной культуре (6 дней). Х5200 (препарат А. С. Халанского, И. В. Викторова). Густое переплетение островков нервных и глиальных клеток, образующих мелкопетлистую сеть, в которой разбросаны тела глиальных клеток (ГК).

119. Глиальные клетки больших полушарий мозга крысы в первичной культуре (6 дней). Х3200 (препарат А. С. Халанского, И. В. Викторова). Видны распластанный астроцит (А) и олигодендроглиоцит (О), сохраняющий компактную форму и связь с аксонами (указано стрелками).

120. Нервные клетки больших полушарий мозга крысы в прилегающей к эксплантату зоне роста (первичная культура - 6 дней). Х8400 (препарат А. С. Халанского, И. В. Викторова). Видны контакты аксонов с телами нервных клеток (указано стрелками). (Нейроны редко мигрируют из эксплантата, обычно посылая наружу только отростки. Их тела и отростки обычно не распластываются на субстрате.)

ГЛАВА 4. СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТАЯ И ЛИМФОСОСУДИСТАЯ СИСТЕМЫ

Сканирующая электронная микроскопия позволила обнаружить сложную организацию рельефа внутренней поверхности органов сердечно-сосудистой системы. Выделяют интимальный рельеф, в образовании которого принимает участие весь комплекс структурных элементов стенки сосуда, и эндотелиальный, особенности которого обусловлены свойствами выстилающих внутреннюю поверхность сосуда эндотелиоцитов.

К интимальному рельефу относят прежде всего продольные складки. Они обусловлены тонусом мышечных элементов сосудистой стенки и свойствами эластической мембраны (см. рис. 121). Характер и выраженность продольных складок во многом зависит от вида фиксации (при иммерсионной фиксации они более выражены), величины артериального давления и видовых особенностей строения стенки сосудов. Продольные складки имеются не во всех сосудах. Они не обнаружены, например, в восходящем отделе аорты, артериях головного мозга, главных ветвях коронарных артерий и др. У места бифуркации сосудов интимальные складки разделяются и следуют в соответствующие ветви (см. рис. 122). Направление хода интимальных складок, как правило, соответствует току крови. Продольные складки амортизируют пульсовую волну и адаптируют стенку сосуда к повышению артериального давления.

Среди специфических рельефных образований на поверхности эндотелиоцитов выделяют маргинальные выросты, поры, фенестры, вздутия и кратеры.

Маргинальные выросты обнаруживаются около границ эндотелиоцитов и характеризуются нерегулярно расположенными на клеточной поверхности микроотростками, складками и микропузырями различной формы и величины. Длина микроотростков обычно не превышает 2 мкм. В ряде случаев границы маркируются выростами не хуже, чем при использовании метода импрегнации серебром (см. рис. 123). Маргинальные выросты являются структурами, с помощью которых эндотелиальный пласт адаптируется к увеличению артериального давления и амортизирует пульсовую волну.

Эндотелиальные порыв СЭМ имеют вид сквозных дырок в периферической зоне эндотелиоцитов, сквозь которые видна поверхность подлежащих тканей (см. рис. 125, 126).

Эндотелиальные фенестры в СЭМ представляют собой углубления диаметром 70-100 нм с плоским дном. Склоны их обычно пологие. Дно фенестры образовано фенестральной диафрагмой.

Вздутия - это расправленные или спавшиеся пузыри, сравнимые по размерам с ядросодержащими возвышениями.

Кратерами ("стигматами") обычно называют округлые или с рваными краями, достаточно глубокие, с подрытыми склонами дырки на поверхности эндотелия, прикрытые шапочкой или без нее.

Вздутия и кратеры являются артефактными образованиями. Они формируются в результате отека проникающих в подэндотелиальный слой отростков гладких миоцитов средней сосудистой оболочки. При высушивании методом перехода критической точки в момент стравливания газа прикрывающий их слой цитоплазмы эндотелиальных клеток может разрываться, и тогда возникает кратер. Если этого не происходит, то вследствие удаления жидкости образующееся пустое пространство может спадаться и формируется спавшееся вздутие.

Остальные рельефные образования, обнаруживаемые на внутренней поверхности различных отделов сердечно-сосудистой системы, соответствуют описанным выше. Отметим лишь, что филоподии (межэндотелиальные мостики) чаще всего являются артефактными структурами, а число микроотростков возрастает при длительной отмывке сосудов солевыми растворами.

Рельеф поверхности эндотелия во многом зависит от местных гемодинамических условий. Например, чем дальше от сердца расположены артериальные эндотелиоциты, тем более выражены ядерные выбухания и маргинальные складки, что обусловлено увеличением амплитуды пульсовой волны (см. рис. 123, 124); количество микроворсинок на поверхности эндотелиоцитов увеличено в областях повышенных гемодинамических воздействий: в синусах аорты и легочных артерий, восходящей части аорты и проксимального отрезка ее дуги, в местах разветвлений артерий (см. рис. 127). Число кавеол обычно в той или иной мере зависит от количества микроотростков, например во время митоза число микроотростков на поверхности эндотелиоцитов возрастает, а количество кальвеол уменьшается (см. рис. 128).

Эндотелиоциты, выстилающие кровеносное русло, большей частью плоские, удлиненной и полигональной формы. Размеры и форма эндотелиальных клеток широко варьируют в зависимости от вида животного, типа и сегмента сосуда. Так, в крупных сосудах эндотелиоциты имеют ширину 7-20 мкм и длину 40-80 мкм. Часто зона перикариона почти не различима и лишь небольшое возвышение указывает на локализацию ядра. Особого рассмотрения заслуживает вопрос о так называемых веретенообразных эндотелиоцитах, имеющих удлиненную форму и резко выступающую в просвет сосуда ядросодержащую зону. Они обнаружены в зонах повышенной гемодинамической нагрузки: в изгибах сосудов, местах бифуркаций и отхождения боковых ветвей. Зонам расположения веретенообразных клеток в сосудистой стенке, как правило, соответствуют локусы повышенной проницаемости для белка и области ускоренного обновления эндотелиального пласта. Вместе с тем нельзя исключить возможность артефактного возникновения веретенообразных эндотелиоцитов вследствие постфиксационных манипуляций. Подобная же перестройка эндотелиальной клетки может быть вызвана манипуляциями на сосудистой стенке перед началом фиксации; частота перестроек возрастает при иммерсионной фиксации. Веретенообразные эндотелиоциты появляются во время регенерации эндотелия (см. рис. 129, 130).

Сердце

Резко уплощенные и распластанные эндотелиальные клетки внутренней оболочки сердца (эндокарда) имеют полигональную форму (см. рис. 131, 132). На их поверхности видны плохо контурирующиеся ядросодержащие возвышения, встречаются маргинальные выросты, короткие микроотростки, чаще обнаруживаемые в тех областях, где кровоток имеет турбулентный характер: в желудочках, на клапанах (см. рис. 131) ив эндокарде, покрывающем капиллярные мышцы (см. рис. 132). Уплощенная периферическая зона эндотелиальных клеток довольно ровная. В предсердиях, наоборот, поверхность эндотелия более гладкая. Структура миокарда и его элементов - кардиомиоцитов, подробно описана выше.

Наружная оболочка сердца (эпикард) образована тонкой пластинкой соединительной ткани, свободная поверхность которой покрыта мезотелием. Клетки мезотелия эпикарда имеют типичную структуру (см. выше).

Артерии

Эндотелиальные клетки артерий более удлиненные, чем таковые в эндокарде. Изучение в СЭМ импрегнированных серебром препаратов позволило установить, что, чем дальше от сердца расположен артериальный сегмент и чем меньше его диаметр, тем более вытянутыми становятся выстилающие артерию эндотелиоциты и тем меньше средний угол отклонения длинных осей эндотелиальных клеток от оси сосуда. В местах разделения кровотока отмеченная закономерность нарушается: расположение клеток эндотелия становится более хаотичным, а форма эндотелиоцитов - неправильной (см. рис. 133). В этих областях в просвет "родительского" сосуда обычно выступает свое образная замкнутая складка, окружающая вход в более мелкую артерию. Ее контур по форме часто напоминает каплю (см. рис. 134). Указанные складки особенно развиты во внутриорганных артериях, что хорошо выявляется на коррозионных препаратах.

Микрорельеф поверхности эндотелиоцитов артерий мало отличается от такового в эндокарде. Следует отметить, однако, что ядросодержащие возвышения и маргинальные выросты больше выражены в артериях мышечного типа (см. рис. 123, 124).

Толщина тонкого соединительнотканного подэндотелиального слоя внутренней сосудистой оболочки больше в зонах турбулентного кровотока. На экстрагированных с помощью муравьиной кислоты препаратах удается различить густое сплетение тонких эластических тяжей внутренней эластической мембраны. В составе сплетения выявляются внутренний циркулярный и наружный продольный слои. При мягкой экстракции удается визуализировать базальную мембрану эндотелия, которая имеет сетчатое строение. При дозированном травлении коррозионных препаратов в подэндотелиальном слое можно визуализировать коллагеновые волокна (см. рис. 136, 137).

Средняя оболочка артерий образована гладкомышечными и эластическими элементами. Строение ее различается у артерий эластического и мышечного типов. В первом случае на экстрагированных с помощью муравьиной кислоты препаратах видны множественные эластические мембраны, связанные друг с другом лентовидными эластическими волокнами, во втором - структура эластического каркаса менее упорядочена. В артериях мышечного типа четко прослеживаются лишь внутренняя и наружная эластические мембраны. Они представляют собой гладкие пластинки, перфорированные небольшими отверстиями, через которые проходят к эндотелию и в адвентицию отростки гладких мышечных клеток. При обработке препаратов соляной кислотой видно, что гладкие миоциты располагаются параллельно друг другу, ориентированы по отношению к продольной оси сосуда почти циркулярно и формируют компактную пластинку.

Эластический каркас средней оболочки состоит из концентрических мембран, образованных соединяющимися между собой пластинками. Однослойные или многослойные пластины формируются эластическими волокнами с упорядоченной направленностью, которые могут сливаться вплоть до образования гомогенных пластин. Это обусловливает разнообразие структурной организации мембран в артериях человека и животных. Расщепление мембран и их анастомозирование придают эластическому каркасу ячеистую структуру, что, возможно, играет определенную роль в питании стенки артерий. Эластические мембраны соединены между собой гладкомышечными клетками, коллагеновыми и эластическими волокнами, которые имеют спиральную ориентацию. Такая ориентация совпадает с направлением эластических волокон, входящих в состав пластин. Подобная стереоархитектоника обеспечивает однонаправленное растяжение мембран, которое ограничивается коллагеновыми волокнами и регулируется сокращением гладких мышц. Мембранный принцип строения всех слоев стенки артерий, по-видимому, отражает ее биохимические свойства и способствует приспособлению сосуда к пульсирующему потоку крови (см. рис. 66, 138).

В зависимости от особенностей строения можно выделить следующие типы эластических мембран средней сосудистой оболочки; гомогенные, волокнистые и смешанные.

Эластические мембраны объединены в целостную систему при помощи коллагеновых волокон, а также гладкомышечных клеток, расположенных в межмембранных промежутках. Независимо от тонкого строения каждая мембрана окружена слоем коллагеновых и ретикулиновых волокон, формирующих своеобразный "футляр", внутри которого расположено вещество эластической мембраны. Пучки коллагеновых фибрилл окружают эластические волокна межмембранных промежутков, а также в виде чехла оплетают гладкомышечные клетки и, прикрепляясь к коллагено-ретикулиновому "футляру", объединяют эти клетки с системой эластических мембран. Следовательно, эластические мембраны состоят из отдельных пластин, которые полностью или частично образованы из цилиндрических эластических волокон, имеющих упорядоченное направление [Нестайко Г. В., Шехтер А. Б., 1983].

Микрососуды

В зависимости от тонуса гладкомышечных клеток внутренняя поверхность артериол может быть либо ровной, либо с резко выраженными продольными складками. Эндотелиоциты артериол вытянуты вдоль оси сосуда и характеризуются относительно гладким рельефом поверхности с немногочисленными микроотростками и маргинальными выростами (см. рис. 139, 140).

После удаления с помощью концентрированной соляной кислоты соединительнотканных элементов стенки артериол хорошо видны вариации формы, упаковки и ориентации гладкомышечных клеток. В крупных артериолах миоциты располагаются очень плотно друг к другу и циркулярно или спиралевидно по отношению к оси сосуда. По мере приближения к капиллярам гладкомышечные клетки постепенно расходятся и между ними образуются увеличивающиеся в ширину промежутки. Одновременно с этим меняется их форма и ориентация. Клетки все более уплощаются и принимают сначала косое расположение, а затем близкое к продольному. Таким образом, наблюдается постепенное замещение гладкомышечных клеток перицитами. Распределение гладкомышечных клеток в артериолах можно изучать и косвенно на основании анализа на коррозионных препаратах так называемых "течей", представляющих собой вытекание инъекционной массы через внутреннюю сосудистую оболочку в соединительнотканное влагалище гладкомышечной клетки. В зоне плотного расположения гладкомышечных клеток "течи" редки; в более удаленных участках артериолярного звена они наблюдаются чаще. При использовании обоих методов не обнаружено локальных скоплений гладкомышечных клеток (сфинктеров) в зонах ветвления прекапилляров на капилляры (см. рис. 135, 141).

В капиллярах рельеф поверхности эндотелия непрерывного типа включает ядросодержащие возвышения, редкие микроотростки, плохо выраженные маргинальные выросты и кавеолы. В фенестрированном и порозном эндотелиях обнаружены радиально расходящиеся от ядросодержащей зоны цитоплазматические гребни, разграничивающие истонченную периферическую цитоплазму на особые "решетчатые" поля фепестр и пор (см. рис. 125).

На химически экстрагированных препаратах капилляров перициты представляют собой клетки звездчатой формы, длинная ось которых ориентирована вдоль осп капилляра, а выросты, древовидно ветвясь, как бы охватывают снаружи эндотелиальную трубку.

В венулах эндотелиоциты более широкие, чем в артериолах, но менее длинные, с разнообразной ориентацией по отношению к оси сосуда. Рельеф поверхности эндотелиальных клеток венул включает микроотростки, маргинальные выросты, кавеолы и нередко - фенестры и поры, что указывает на участие венул в выполнении обменных функций. Гладкомышечные клетки средней оболочки крупных венул более уплощенные, чем артериол, и характеризуются циркулярно-спиральным расположением.

Изучение в СЭМ коррозионных препаратов последовательных звеньев микроциркуляторного русла позволило установить артериоло-капилляро-венулярный градиент формы и ориентации эндотелиоцитов: отпечатки ядросодержащих возвышений эндотелиоцитов в артериолах более узкие и глубокие, строго ориентированные вдоль оси микрососуда; в венулах они имеют овальную форму и более разнообразную ориентировку вдоль оси микрососуда (см. рис. 140).

Данные, полученные с помощью СЭ микроскопии, легли в основу новой классификации эндотелия микрососудов, согласно которой выделяют 5 типов эндотелиальной выстилки [Fujita Т. et al., 1981].

-- Закрытый тип (эндотелиальный слой не имеет перфораций). Этот тип также называют мышечным (соматическим) или непрерывным по классификации, основанной па данных просвечивающей электронной микроскопии.

-- Порозный или фенестрированный тип. Этот тип широко встречается в капиллярах почек и эндокринных органов (см. рис. 125).

-- Крупнофепестрированный или печеночный тип. В этом типе наряду с многочисленными различного размера внутриклеточными порами встречаются небольшие отверстия между эндотелиальными клетками. Диаметр пор широко варьирует и может достигать 1 мкм (см. рис. 126).

-- Решетчатый тип (эндотелий с зияющими межклеточными щелями). Этот специализированный тип эндотелия встречается в синусах селезенки и образуется параллельно расположенными палочковидными эндотелиоцитами, которые контактируют между собой боковыми отростками с формированием открытых межклеточных промежутков веретеновидной формы. Через них мигрируют клетки крови.

-- Ретикулярный тип наблюдается в посткапиллярных венулах лимфатических органов. Толстые эндотелиальные клетки звездчатой формы имеют боковые отростки, которые переплетаются, тесно соприкасаясь друг с другом и с телами смежных эндотелиоцитов. Через промежутки между отростками могут мигрировать лимфоциты (см. рис. 142).

В свою очередь трехмерная организация микрососудистых конструкций может быть классифицирована следующим образом.

Микрососудистые конструкции

-- Сети (конструкции, в которых микрососуды взаимодействуют между собой в одной плоскости).

-- Простые (серозная оболочка и капсулы органов).

-- Оплетающие (альвеолярная сеть капилляров легких, перифолликулярные сети щитовидной железы).

-- Сплетения (трехмерные конструкции микрососудов).

-- Относительно изолированные (клубочек почки, сальник, микрососудистое сплетение кишечной ворсинки).

-- Неизолированные:

а) упорядоченные (с преимущественной ориентацией микрососудов
в определенном направлении: капиллярные сплетения мышц, синусоидов печени);

б) неупорядоченные (микрососуды не имеют определенной ориентации):
- кавернозные (желтое тело и кавернозные тела полового члена).

Вены

Люминальная поверхность эндотелия в венах чрезвычайно уплощена, ядросодержащие возвышения почти не различимы. Микроотростки встречаются очень редко. Эндотелиальные клетки имеют полигональную форму; они слабо ориентированы по току крови. Маргинальные выросты встречаются нерегулярно. Сквозь эндотелиальный пласт "проступают" соединительнотканные волокна. При заполнении вен инъекционной массой под повышенным давлением на поверхности отпечатков проступает регулярная сеть соединительнотканных волокон, придающая поверхности слепка сетчатый вид. На сколах неотмытых сосудов просвет вен заполнен эндотелиоцитами (см. рис. 144-147).

Лимфатические сосуды

Эндотелиальные клетки крупных лимфатических сосудов также имеют ядросодержащие возвышения и маргинальные выросты, но поверхность их в основном гладкая. Контуры эндотелиоцитов ровные, а форма - полигональная. В лимфатических сосудах сердца встречаются как ромбовидные, так и полигональные многогранные эндотелиоциты.

В сосудах меньшего диаметра края клеток зигзагообразные, что является одной из характерных особенностей лимфатического эндотелия. Ориентация клеток эндотелия по току лимфы выражена слабо. По мере увеличения калибра лимфатических сосудов клетки эндотелия становятся более ориентированными вдоль оси сосуда.

На люминальной поверхности ряда лимфатических сосудов имеются своеобразные гребни, включающие в себя множество эндотелиоцитов и тянущиеся вдоль направленного потока лимфы.

Межклапанные сегменты лимфатических микрососудов имеют форму воронок, обращенных суженной частью по направлению лимфотока к центральным отделам лимфоциркуляторного русла. Клапаны лимфатических сосудов обычно бикуспидальные и имеют две брыжейки, подвешивающие створки и, вероятно, играющие важную роль в предупреждении вывертывания клапана. Наиболее частый тип прикрепления створок клапанов- это схождение клапанов и их прикрепление в одной точке. Другой тип характеризуется тем, что одна створка клапана перекрывает другую у самого места прикрепления.

На коррозионных препаратах в СЭМ внеорганные лимфатические сосуды имеют вид слегка уплощенных прямых трубок с диаметром 200-450 мкм. На их поверхности прослеживаются V-образные вдавления, соответствующие клапанам. Внешне подобная структура напоминает колос, вершина сегментов которого направлена по току лимфы.

Внутриорганные лимфатические микрососуды уплощены и часто формируют сплетения, окружающие полостные образования или идущие вдоль поверхности органов. На коррозионных препаратах они выглядят как анастомозирующие лакуны неправильной формы (см. рис. 148, 149, 150).

121. Грудной отдел аорты кролика X1000. Видны продольные интимальные складки. Эндотелиальные клетки, покрывающие внутреннюю поверхность стенки сосуда, имеют ровную поверхность. Хорошо заметны маргинальные выросты в зонах межклеточных контактов.

122. Вход в межреберную артерию в аорте кролика. Х200. Видны хорошо выраженные интимальные складки на поверхности сосудов. На дистальной стенке входа складки отсутствуют.

123. Тощекишечная артерия брыжейки крысы. Х4500. Эндотелиоциты, покрывающие внутреннюю поверхность стенки сосуда, имеют выраженные маргинальные выросты, хорошо маркирующие межэндотелиальные контакты и скопления микроотростков над ядрами клеток. Слева видна интимальиая ямка выстланная эндотелием.

124. Междолевая артерия печени крысы. Х1000. Видны веретеновидные эндотелиоциты.

125. Мелкопорозный эндотелий клубочковых капилляров почки крысы. Х20000. Между полями пор видны тяжи цитоплазмы (указаны стрелками). Определяется межклеточный контакт (МК).

126. Крупнопорозный эндотелий синусоидов печени крысы, X17000. Поры имеют разные размеры, сквозь них заметны микроворсинки гепатоцитов. Слева на поверхности гепатоцита виден желчный полуканалец.

127. Синус аорты крысы недалеко от начала левой коронарной артерии. Х2800. Покрывающие поверхность сосуда эндотелиоциты неправильной формы расположены хаотично и имеют много выростов плазмолеммы.

128. Брюшной отдел аорты крысы. Х3000. В центре видны два делящихся эндотелиоцита в стадии телофазы. На их поверхности заметны многочисленные микроотростки и микропузыри.

129. Брюшной отдел аорты крысы. Х1900. Мигрирующие веретеновидные эндотелиоциты во время регенерации поврежденного пласта. Слева внизу видна деэндотелизированная поверхность, покрытая тромбоцитами.

130. Брюшной отдел аорты крысы. Синтезирующие ДНК эндотелиоциты во время регенерации повреждения пласта. Авторадиографический препарат. Х1900. Над ядросодержащими возвышениями находятся гранулы серебра, маркирующие места включения меченого тимидина.

131. Наружная поверхность левого полулунного клапана сердца крысы. Х2100. На поверхности эндотелиоцитов видны микроотростки и хорошо развитые маргинальные выросты.

132. Папиллярные мышцы левого желудочка сердца крысы. Х120. Хорошо видно, что их поверхность покрыта мелкими полигональными эндотелиоцитами.

133. Вход в межреберную артерию в аорте крысы. Х250. Импрегнация азотнокислым серебром. Отчетливо определяется появление удлиненных веретеповидных эндотелиоцитов в месте ответвления межреберной артерии.

134 Вход в межреберную артерию в аорте крысы. Х200. Вокруг входа расположена каплевидная выступающая в просвет сосуда складка внутренней сосудистой оболочки.

135. Внутриорганная артерия околоушной слюнной железы крысы. Коррозионный препарат. Х150. Инъекционная масса заполнила соединительнотканные влагалища гладких мышечных клеток средней сосудистой оболочки. Хорошо виден циркулярный характер расположения гладких миоцитов (препарат В. К. Шишло).

136. Грудной отдел аорты крысы. Обработка муравьиной кислотой. Х11ОО. На внутренней поверхности стенки сосуда видна сетчатая базальная мембрана, подстилающая эндотелий.

137. Место отхождения межреберной артерии от аорты крысы. Дозированная мацерация. Коррозионный препарат. Х200. Видны продольные пучки коллагеновых волокон.

138. Стенка грудного отдела аорты крысы. Х500. Видны эластические мембраны с отверстиями. Эластические мембраны средней сосудистой оболочки соединены друг с другом лентовидными тяжами.

139. Поперечный срез мелкой артерии брыжейки крысы. Х200. Слева внизу виден срез соответствующей вены. Ячейки вокруг сосудов являются жировыми клетками, капли жира из которых удалены в процессе обезвоживания. Внутренняя эластическая мембрана при перфузионной фиксации не образует продольных складок.

140. Артерия и артериола сальника крысы. Коррозионный препарат. Х190. Заметны продольные интимальные складки на поверхности слепков артериальных сосудов. Внизу виден слепок вены.

141. Артерия селезенки крысы. Коррозионный препарат. Х250. На слепке прослеживается продольный рельеф люминальной поверхности сосуда. Инъекционная масса заполнила соединительнотканные влагалища гладких мышечных клеток средней оболочки стенки сосуда. Хорошо заметен циркулярный ход гладких мышечных клеток.

142. Ретикулярный эндотелий посткапиллярных венул лимфатических узлов крысы. Х8100. Эндотелиоциты имеют шарообразную форму.

143. Клубочковая конструкция сальника крысы. Коррозионный препарат. Х600. видна сеть капилляров с питающими ее сосудами.

144. Задняя полая вена крысы. Х4000. Эндотелиоциты, покрывающие внутреннюю стенку сосуда, имеют гладкую поверхность. Вдоль межклеточных контактов определяются маргинальные выросты (указано стрелкой). Ядросодержащие возвышения эндотелиальных клеток хорошо выражены.

145. Задняя полая вена крысы. Х1200. Видны выпячивающиеся в просвет ядросодержащие возвышения и проступающие сквозь эндотелий пучки коллагеновых волокон стенки сосуда, расположенные косо и продольно.

146. Вена сальника крысы. Коррозионный препарат. Инъекция под повышенным давлением. Х190. Видны вдавленные в слепок коллагеновые волокна стенки сосуда.

147. Разрез заполненной эритроцитами вены сальника крысы. Х1500. Внизу виден мезотелий, покрывающий сальник, вверху - жировые клетки.

148. Лимфатические сосуды эпикарда крысы. Коррозионный препарат. X170. Комковые образования представляют собой "течи" инъекционной массы. Они соединены с лимфатическими капиллярами (ЛК). В центре виден слепой конец лимфатического капилляра (указано стрелкой); справа вверху - венула (В).

149. Перибилиарное сплетение лимфатических сосудов печени крысы. Х240 (коррозионный препарат С. И. Катаева). Видна петлистая сеть лимфатических сосудов (ЛС), впадающая в отводящий коллектор (К). У-образные вдавления на слепках (указано стрелками) соответствуют клапанам. Округлые вдавления образованы ядросодержащими зонами эндотелиоцитов.

150. Перибилиарный лимфатический сосуд печени крысы (фрагмент рис. 149). Х460 (коррозионный препарат С. И. Катаева). У-образное вдавление на слепке (указано стрелкой) образовано двустворчатым клапаном. Округлые вдавления - отпечатки ядросодержащих зон эндотелиоцитов.

ГЛАВА 5. ОРГАНЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ

Костный мозг

Красный костный мозг во взрослом организме заполняет губчатое вещество плоских костей и эпифизов трубчатых костей (см. рис. 151). Желтый костный мозг находится в диафизах трубчатых костей. Он представляет собой перерожденную ретикулярную ткань, клетки которой содержат жировые включения.

Кровоснабжение костного мозга. Питающая артерия формирует центральные артерии, идущие вдоль длинника кости. От них радиально отходят довольно длинные, прямые артериолы, заканчивающиеся тонкими капиллярами, которые впадают в венозные синусы - большие тонкостенные сосуды. Последние начинаются на периферии и идут к центру кости, где впадают в центральную продольную вену, отдающую кровь в большую питающую вену. На периферии костного мозга венозные синусы начинаются от прободающих артериол, идущих по центральным каналам остеона.

Стенки венозных синусов изнутри выстланы плотно прилегающими друг к другу эндотелиальными клетками, расположенными на базальной мембране. Эндотелиальные клетки значительно уплощены, на их поверхности не обнаруживается ядросодержащих возвышений, однако иногда встречаются единичные микроворсинки. Выявлены 2 типа отверстий в эндотелиаль-ной выстилке (см. рис. 152). 1-й тип - большие отверстия (1 - 3 мкм в диаметре); 2-й тип - мелкие поры (50-100 нм), образующие скопления. Первые либо заняты мигрирующими клетками, либо эти клетки к ним прикреплены (см. рис. 153). Маленькие поры определяются в начальной стадии фенестрации, вызываемой контактом мигрирующей в просвет сосуда клетки крови с эндотелием, а большие отверстия могут образовываться путем слияния смежных пор.

К базальной мембране эндотелия со стороны, противоположной просвету синуса, прилежат ретикулярные клетки, выполняющие роль адвентиции (см. рис. 152). Однако эти клетки не образуют сплошного, покрывающего синус снаружи, слоя. В ответ на воздействия, стимулирующие процесс кроветворения, происходит быстрое сжатие ретикулярных клеток, в результате чего эндотелиальная выстилка становится более проницаемой для мигрирующих в кровоток клеток.

Гемопоэтическая ткань. В состав костного мозга входят гемопоэтические, ретикулярные клетки (см. рис. 151, 155), макрофаги, мегакариоциты, тучные клетки, а также ретикулярные и коллагеновые волокна.

Эритропоэз у млекопитающих протекает в эритробластических островках, представляющих собой своеобразные морфо-функциональные единицы. Особенно хорошо эритробластические островки видны на сколах костного мозга (см. рис. 154, 157). В центре островка находится центральный макрофаг. Вокруг в один или несколько слоев расположены эритробласты, плотно к нему прилегающие. В одном эритробластическом островке могут быть эритробласты на разных стадиях созревания. Диаметр центрального макрофага больше диаметра эритробласта в 1,3- 1,5 раза. Встречаются и очень крупные макрофаги, что, по-видимому, обусловлено их функциональным состоянием.

Известны следующие функции центральных макрофагов: 1) поглощение "выброшенных" ядер эритробластов (см. рис. 154); 2) фагоцитоз поврежденных клеток; 3) перенос железа в виде ферритина в цитоплазму развивающихся эритробластов путем микропиноцитоза.

Созревающие эритробласты либо находятся в тесном контакте с центральным макрофагом, либо соединены с ним отростками (см. рис. 154). Наиболее зрелые клетки (ретикулоциты, эритроциты) уже не связаны с макрофагами и могут располагаться вдали от него (см. рис. 154, 156). Зрелые клетки легко отличить от остальных. Эритроциты имеют характерную двояковогнутую форму. Ретикулоциты лишены ядра, имеют гладкую поверхность, а по размерам и форме близки к эритроцитам. По мере созревания эритроидных клеток, их поверхность меняется: из неровной, имеющей множество элементов рельефа, она становится гладкой. При этом поверхность каждого типа клеток, как правило, на ранней и более поздней стадии имеет характерные черты. Базофильные проэритроциты имеют неровную поверхность с многочисленными мелкими складками на одной половине клетки и отдельными короткими микроворсинками на другой (см. рис. 155). Клетки с неровной поверхностью и отдельными микроворсинками - это ранние полихроматофильные проэритроциты, а без микроотростков, но с "порами" - поздние полихроматофильные проэритроциты (см. рис. 154, 155, 157). Оксифильные проэритроциты -это клетки с ровной поверхностью и "порами" (см. рис. 156) (Для идентификации эритроидных клеток костного мозга по форме их поверхности был разработан специальный метод последовательного изучения одних и тех же клеток сначала в световом, а потом в сканирующем электронном микроскопе.)

Гранулоцитопоэтические клетки в костном мозге образуют скопления, которые не содержат центральных макрофагов. Однако около таких скоплений можно обнаружить и макрофаги.

Среди кроветворных элементов костного мозга встречаются гигантские полиплоидные клетки, называемые мегакариоцитами. Другой клеточной формой, имеющей большие размеры, являются жировые клетки, число которых увеличивается с возрастом (см. рис. 151). Тромбоциты, циркулирующие в крови, образуются из отростков мегакариоцитов. Тела последних локализуются экстравазально (см. рис. 152) и обычно прилежат к базальной мембране эндотелия, однако их длинные тонкие червеобразные цитоплазматические отростки выходят через отверстия в эндотелии в просвет сосуда и занимают пристеночное положение, вытянувшись вдоль его оси. Отростки мегакариоцитов заканчиваются округлыми утолщениями, которые по размерам и форме соответствуют индивидуальным тромбоцитам (см. рис. 152). По ходу червеобразных отростков иногда встречаются сужения и утолщения. Индивидуальные тромбоциты освобождаются в циркулирующую кровь путем отщепления этих утолщений, причем могут отшнуровываться и большие сегменты цитоплазмы, которые подвергаются дальнейшей фрагментации на отдельные тромбоциты.

Существует две разновидности ретикулярных клеток: крупные уплощенные клетки, имеющие короткие плоские отростки (см. рис. 154), и небольшие клетки неправильной формы с длинными тонкими ветвящимися отростками - филоподиями, покрытыми пузырьками (см. рис. 152, 155).

Клетки стромы обеспечивают микроокружение, необходимое для осуществления гемопоэза.

Лимфатический узел

Тонкая капсула, покрывающая лимфатический узел, обычно тесно связана с окружающей жировой тканью (см. рис. 158). От капсулы внутрь органа отходят соединительнотканные перегородки (трабекулы), формирующие вместе с ретикулярной тканью строму органа. Лимфатические фолликулы на поверхности скола недостаточно отмытого от лимфы органа выглядят как плотные образования с относительно гладкой поверхностью, в которых невозможно подчас различить отдельные клеточные элементы. Однако, если орган предварительно тщательно отмыть от лимфы путем перфузии и препарат приготовить путем разрыва высушенного образца, то в области лимфатических фолликулов идентифицируются отдельные клетки, имеющие характерный микрорельеф с выраженными микроскладками и микроотростками (см. рис. 159). Фолликулы состоят главным образом из лимфобластов, лимфоцитов и макрофагов, расположенных в поддерживающей сети ретикулярных клеток и волокон. Лимфатические фолликулы являются центрами пролиферации и дифферснцировки В-лимфоцитов.

Лимфатические фолликулы идут в мозговое вещество лимфатического узла в виде мякотных тяжей. Последние отделены от синусов монослоем эндотелиальных клеток, иногда называемых "береговыми" (см. рис. 160). Мякотные тяжи представлены плотно упакованными клеточными элементами - лимфобластами, плазматическими клетками, ретикулярными клетками и макрофагами. Плазмоциты могут проникать через эндотелиальную выстилку и контактировать с лимфой, протекающей через лимфатический узел.

Лимфоснабжение. Лимфа поступает в лимфатический узел через один или несколько приносящих лимфоносных сосудов, которые перед входом со стороны его выпуклой поверхности несколько раз ветвятся. Каждая из ветвей, за исключением терминальных, имеет клапаны. Своими створками клапаны обращены к лимфатическому узлу, препятствуя тем самым обратному току лимфы. Из сосудов лимфа поступает в краевой синус (см. рис. 158). Из краевого (подкапсульного) синуса лимфа движется в вокругузелковый корковый синус (см. рис. 159), представляющий собой туннель с нечетко выраженной стенкой, затем она попадает в более глубокую зону коркового вещества- в мозговой промежуточный синус. Переходы синусов друг в друга можно довольно легко увидеть на высушенных, а затем разорванных препаратах (см. рис. 159).

В синусах содержится большое количество ретикулярных клеток. Они имеют множество длинных и тонких отростков, идущих в различных направлениях. Сеть ретикулярных клеток и их отростков, пересекающая пространство синуса, служит для создания турбулентности в потоке лимфы, что облегчает ее фильтрацию через лимфатический узел. В синусном пространстве в значительном количестве имеются лимфоциты и макрофаги. Последние фиксированы на поверхности ретикулярных клеток (см. рис. 161). Такое расположение макрофагов создает благоприятные условия для их взаимодействия с антигенами, приносимыми лимфой, и лимфоцитами, проходящими через синус.

Стенки синусов выстланы эидотелиальными клетками (см. рис. 162). В эндотелиоцитах имеется множество транзиторных отверстий, через которые лимфоидные клетки выходят из пульпы в синус. На поверхности эндотелиоцитов часто видны так называемые розетки, представляющие собой несколько лимфоцитов, прикрепленных к поверхности макрофага (см. рис. 160). На рис. 162 видны единичные лимфоциты в процессе миграции через эндотелий. Ретикулярные волокна, которые располагаются в полости синусов, со всех сторон окружены цитоплазмой ретикулоцитов (см. рис. 161), этим исключается контакт ретикулярных волокон с протекающей лимфой. Большая часть лимфы свободно проходит по синусам, однако отдельные лимфоциты прикрепляются к фиксированным на сети ретикулярных клеток макрофагам. Лимфа также фильтруется через щели лимфоидной ткани органа (диффузионные каналы). Таким образом, в мозговой синус впадает лимфа, прошедшая как по корковым синусам, так и по диффузионным каналам. Мозговой промежуточный синус переходит в мозговой воротный синус, который соединяется с выносящим лимфатическим сосудом, выходящим из ворот органа (см. рис. 163).

Кровоснабжение. Лимфатические узлы снабжаются кровью из артерий, входящих в ворота, и нескольких мелких артерий, подходящих со стороны выпуклой поверхности узла. Входящие в ворота артерии проходят по трабекулам, далее они вступают в мозговое вещество (см. рис. 164), где древовидно ветвятся на артериолы. К каждому фолликулу подходит по 1-2 артериолы, которые, распадаясь на капилляры, формируют микрососудистое сплетение, довольно редкое в центральных частях фолликула (см. рис. 165, 166). Анастомозирующие петли капилляров сливаются в венулы, формирующие вокруг фолликула венозное сплетение. Посткапиллярные венулы идут через глубокие зоны коркового вещества и входят в мякотные тяжи, где они переходят (см. рис. 167) в вены мякотных тяжей, затем покидая орган через его ворота. Отличительной особенностью посткапиллярных венул является их выстилка, образованная так называемым высоким (ретикулярным) эндотелием (см. рис. 168, 169, 170). Выход лимфоцитов из кровеносного русла через посткапиллярные венулы связывают с особыми свойствами этого эндотелия, в частности, со способностью формировать широкие межэндотелиальные щели. В то же время считают, что лимфоциты мигрируют из посткапиллярных венул не только через межклеточные щели, но и непосредственно через высокие эндо-телиальные клетки. По-видимому, здесь имеет место специфическая адгезия циркулирующих в крови лимфоцитов к эндотелиальным клеткам посткапиллярных венул.

Селезенка

Покрывающая селезенку фиброзная оболочка отдает в паренхиму органа отростки - перекладины (трабекулы). Паренхима селезенки состоит из красной и белой пульпы. Красная пульпа (см. рис. 171) содержит много больших тонкостенных сосудов - венозных синусов. Между ними располагаются прослойки клеток, называемые селезеночными тяжами. Строму красной пульпы селезенки образует ретикулярная ткань. В красной пульпе происходит процесс удаления из крови дефектных эритроцитов. Белая пульпа представлена лимфатическими узелками, беспорядочно разбросанными по всей селезенке (см. рис. 172) и служащими местом кооперативных взаимодействий Т- и В-лимфоцитов с фагоцитирующими антигены макрофагами. В белой пульпе идет продукция новых лимфоцитов. На сколе белая пульпа имеет вид цилиндрических тяжей, содержащих плотно упакованные агрегаты лимфоцитов, лимфобластов, ретикулярных клеток и макрофагов.

В каждом лимфатическом узелке селезенки, несколько отступая от центра, расположена центральная артерия. Под СЭМ лимфатическое периартериальное влагалище вокруг нее - это довольно плотное образование, в котором индивидуальные клеточные элементы различимы плохо. На сколе влагалище имеет ровную поверхность (см. рис. 172). Оно окружено так называемой краевой зоной красной пульпы. Эта зона содержит плотную сеть ретикулярных клеток и волокон. Здесь происходит первичное взаимодействие между антигенами, макрофагами и лимфоцитами.

Кровь поступает в селезенку через селезеночную артерию, которая делится на несколько ветвей - трабекулярных артерий, проходящих в перекладинах и питающих центральные артерии. На коррозионных препаратах центральную артерию окружает пустое пространство - место, где располагается белая пульпа (см. рис. 173). От центральной артерии отходит два типа ветвей. Первый тип - перпендикулярно от нее отходит множество тонких прямых фолликулярных артериол (прекапилляров), которые пересекают белую пульпу и впадают в краевые синусы красной пульпы (см. рис. 173). Краевые синусы представляют собой анастомозирующие полости, окруженные селезеночными тяжами. Второй тип - конечная артерия переходит в кисточковую артериолу, перпендикулярно уходящую в красную пульпу через зону краевых синусов (см. рис. 174). Кисточковые пульпарные артериолы либо дают веточки, соединяющие их с венозными синусами красной пульпы (закрытый тип циркуляции), либо прямо открываются во внесосудистое пространство между селезеночными тяжами (открытая селезеночная циркуляция).

В кисточковых артериолах различают проксимальную часть - эллипсоидную (вагинальную) артериолу, снабженную муфтой из уплотненной ретикулярной ткани, и дистальную, переходящую в короткие(60-90 мкм) кончевые артериальные гемокапилляры с просветом около 10 мкм. При исследовании коррозионных препаратов с ограниченным количеством введенной в сосуды инъекционной массы под СЭМ видно, что центральные артерии на некотором расстоянии окружены сплетением краевых синусов, а пространство между последними почти не заполнено инъекционной массой (см. рис. 175). Если объем инъекционной массы не ограничивать, то пространство между конечными синусами будет занято сетью заполненных смолой венозных синусов (см. рис. 176), начинающихся от краевых синусов.

В настоящее время считают, что в селезенке имеет место как открытый, так и закрытый тип циркуляции.

Венозные синусы отдают кровь в многочисленные пульпарные вены, которые сливаются друг с другом с образованием трабекулярных вен (см. рис. 177). Из них формируется селезеночная вена, выходящая из ворот селезенки.

При исследовании тщательно отмытых от крови препаратов видно, что венозные синусы представляют собой специализированные сосуды диаметром 10-40 мкм, выстланные палочковидными эндотелиоцитами (см. рис. 178). Эндотелиальные клетки располагаются вдоль оси сосуда параллельно друг другу и соединяются только своими боковыми отростками. Вследствие этого в стенке синусов между эндотелиоцитами образуются щелевидные удлиненные отверстия. Люминальная поверхность эндотелиоцитов большей частью гладкая, хотя иногда встречаются единичные микроотростки. Овальные ядра палочковидных эндотелиоцитов выдаются в просвет синусов. Округлые тела на стенке синусов представляют собой эритроциты, застрявшие в межэндотелиальных щелях.

Снаружи синусы покрыты прерывистой базальной мембраной. В участках межэндотелиальных контактов имеется сплошная базальная мембрана. Кроме того, стенки синусов оплетены кольцевидными отростками ретикулярных клеток, расположенных в селезеночных тяжах (см. рис. 179). Эти отростки окружают со всех сторон кольцевидные ретикулярные волокна, располагающиеся в поперечных бороздках на наружной поверхности палочковидных эндотелиоцитов в областях контактов их боковых отростков с соседними эндотелиальными клетками. Поэтому ретикулярные волокна в СЭМ обычно не видны.

Застрявшие в стенке синуса эритроциты всегда своей круглой головкой обращены в полость синуса, а внешняя суженная часть остается снаружи (см. рис. 180). Если эритроциты имеют увеличенную ригидность, то они не могут пройти через отверстие в эндотелии, остаются в пульпе и разрушаются макрофагами. Накопление в пульпе старых эритроцитов является стимулом для дифференцировки моноцитов в свободные и фиксированные макрофаги.

Пространство вокруг венозных синусов заполнено клеточными элементами и сетью ретикулярных фибробластоподобных клеток. Их удлиненные отростки образуют шнуры, поддерживающие сосудистую стенку. В сети ретикулярных клеток видны макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты и плазматические клетки. Эти клеточные формы в совокупности и образуют селезеночные тяжи. Макрофаги идентифицируются по их характерной шероховатой с множеством микроотростков поверхности; они прикреплены как к ретикулярным клеткам, так и к палочковидным эндотелиоцитам. Форма их округлая или амебовидная. Макрофаги через отверстия в стенке синуса могут легко перемещаться в просвет сосуда и обратно.

По данным Т. Fujita и соавт. (1981), в селезенке человека имеет место открытый тип циркуляции. Кисточковые артерии заканчиваются перфорированными вздутыми терминалями. Через имеющиеся здесь отверстия клетки крови выходят в селезеночные тяжи. При раскалывании такого вздутия видно, как клетки крови проходят через эндотелий. Межэндотелиальные щели здесь имеют размеры 1-2 мкм, поэтому мигрирующие через них эритроциты выглядят перетянутыми.

Исследования в СЭМ коррозионных препаратов показали, что ветви кисточковых артерий могут подходить очень близко к венозным синусам, но не вступают с ними в прямой контакт. Они продолжаются в гранулярные скопления инъекционной массы, которые соответствуют расширенным межклеточным пространствам селезеночных тяжей, или краевым синусам.

Гранулярные скопления в свою очередь соединяются с колбасовидными слепками венозных синусов.

Вилочковая железа

Дольки вилочковой железы изолированы одна от другой отходящими от капсулы соединительнотканными перегородками (см. рис. 181, 182). Корковое вещество дольки выглядит более компактным, чем мозговое (см. рис. 182). Клетки (тимоциты) здесь тесно прилегают друг к другу. Тимоциты имеют "чеканную" полигональную форму с четкими гранями и углами (см. рис. 183); поверхность их гладкая. Незрелые тимоциты коркового вещества представляют собой гомогенную популяцию с очень незначительным разнообразием в размерах и форме; они способны к интенсивному делению. Эти клетки мигрируют в мозговое вещество, дифференцируясь в иммунокомпетентные Т-лимфоциты. Последние покидают вилочковую железу через стенку сосудов, расположенных в мозговом веществе.

Кроме лимфоидных элементов, в корковом веществе расположены так называемые эпителиоретикулярные клетки (см. рис. 183). Они представляют собой многоотростчатые, часто ветвящиеся клеточные элементы. Выросты одного эпителиоретикулоцита прикрепляются к отросткам соседнего. Тем самым эти клетки образуют своеобразную трехмерную сеть, в ячейках которой и находятся лимфоциты и лимфобласты. Это особенно хорошо видно на разорванных после высушивания препаратах. Ретикулярные волокна не связаны с эпителиоретикулярными клетками.

В мозговом веществе дольки тимоцитов имеют более округлую форму. Здесь встречаются своеобразные тельца вилочковой железы. Они представляют собой эпителиоретикулоциты, концентрически расположенные вокруг кератиновых масс или кальцифицирующихся субстанций.

Как в корковом, так и в мозговом (в меньшей степени) веществе обнаруживаются макрофаги с характерным микрорельефом поверхности (см. рис. 183). Макрофаги осуществляют функцию "санитарного надзора", разрушая неправильно функционирующие лимфоциты. Они имеют большие размеры и обычно окружены множеством лимфоцитов. Последние адгезируются на поверхности макрофагов, образуя "розетки".

Кровоснабжение. Сосуды, питающие вилочковую железу внутри органа, делятся на междольковые и внутридольковые. Последние формируют дуговые артериолы. Эти сосуды расположены на месте соединения коркового и мозгового вещества дольки. На коррозионных препаратах видно, что от дуговых артериол под углом, почти равным 90®, отходят очень тонкие кровеносные капилляры (см. рис. 184, 185, 186). Они идут радиально по направлению к корковому веществу.

Капилляры окружены довольно толстой непрерывной базальной мембраной и перицитами. Изредка в их субэндотелиальных пространствах обнаруживаются макрофаги. Эпителиоретикулоциты формируют своеобразный футляр, охватывающий микрососуд. Пластинка их собственной базальной мембраны видна внутри футляра. Все эти образования участвуют в формировании тимогематического барьера. Последний имеет определенное значение для предупреждения попадания антигенов в корковое вещество вилочковой железы после рождения.

Большая часть корковых радиальных капилляров переходит в подкапсульные венулы. Меньшая часть капилляров (они более извилистые) идет в мозговое вещество и на границе с корковым веществом переходит в посткапиллярные венулы (см. рис. 184). Именно через эти венулы, имеющие высокий эндотелий, осуществляется выход созревших лимфоцитов в кровоток. Т-лимфоциты, мигрирующие через стенку венулы, всегда круглые, с редкими, но четкими ундуляциями и микроворсинками на поверхности.

Капилляры, питающие мозговое вещество, и посткапиллярные венулы не имеют таких барьерных приспособлений, как капилляры коркового вещества, о чем свидетельствуют экстравазаты ("течи") инъекционной массы, которые на коррозионных препаратах образуются на уровне кортикомедуллярного соединения (см. рис. 185). Подкапсульные вены сливаются и формируют вену, отводящую кровь от коркового вещества дольки. Посткапиллярные венулы впадают в междольковые вены. Таким образом, отток крови из коркового и мозгового вещества происходит раздельно.

151. Грудина крысы. Красный костный мозг. Х800 (препарат А. А. Миронова, В. А. Миронова). Хорошо заметны идущие сверху вниз и слева направо два синусоида, на стенке которых видны прикрепленные и мигрирующие через эндотелий лимфоциты и эритроциты. Слева внизу и вверху находятся два шаровидных углубления - жировые клетки, принявшие такой вид из-за вымывания жира при обезвоживании препарата. В гемопоэтической ткани заметно множество расколотых клеток разной степени зрелости.

152. Грудина крысы. Красный костный мозг. Х2900 (препарат А. А. Миронова, В. А. Миронова). Стенка синусоида представлена уплощенными эндотелиальными клетками, в которых имеются поры (указано стрелками) различного размера. В центре виден лимфоцит, прикрепившийся к эндотелию. Через поры проходят отростки мегакариоцитов, находящиеся в пристеночном положении. Внизу виден отщепляющийся от них тромбоцит. Внизу различимы ретикулярные клетки, макрофаги и мегакариоциты (указано двойной стрелкой).

153. Грудина крысы. Красный костный мозг. Х2600 (препарат А. А. Миронова, В. А. Миронова). На стенке синусоида видны прикрепившиеся с помощью отростков лимфоциты. Внизу - сколотые созревающие клетки эритроидного ряда.

154. Эритробластический островок костного мозга мыши. X14 400 (препарат Е. И. Заболотных). В центре видны два макрофага (М). Вокруг них находятся созревающие эритроидные клетки. В тесном контакте с макрофагом лежит оксифильный проэритроцит (ОП) в начальный момент выброса ядра. Ядро выпячивается в сторону макрофага; остальная часть клетки сокращается. Проэритроцит лежит на плоской поверхности ретикулярной клетщ (РК). Внизу справа видны полихроматофильные проэритроциты (ПП). Небольшие клетки неправильной формы с гладкой поверхностью - ретикулоциты (Р). Хорошо виден отросток центрального макрофага, при помощи которого он взаимодействует с полихроматофильным проэритроцитом (указано стрелкой), и короткий отросток ретикулярной клетки (указано двойной стрелкой).

155. Эритробластический островок костного мозга мыши. Х17 280 (препарат Е. И. Заболотных). Внизу виден центральный макрофаг (М), возле которого расположены проэритроциты: базофильные (БП), полихроматофильные ранние (ППР), полихроматофильный поздний (ППП), оксифильный (ОП), ретикулоцит (Р). Видны две ретикулярные клетки (РК) сложной формы с длинными отростками, покрытыми многочисленными пузырьками. Хорошо видно, что одна ретикулярная клетка может одновременно взаимодействовать с проэритроцитами разной степени зрелости.

156 Эритробластический островок костного мозга мыши. Х21 600 (препарат
Ь. И. Заболотных). Вокруг центрального макрофага лежат оксифильные проэритроциты. На их гладкой поверхности отчетливо видны "поры". Слева внизу
виден ретикулоцит. На его поверхности также есть "поры", но уже нет ядра по форме он приближается к эритроциту. Дефектные клетки фагоцитируются макрофагом.

157 Эритробластический островок костного мозга мыши. X23 760 (препарат Е И Заболотных). В непосредственной связи с макрофагом (М) находится поздний полихроматофильный проэритроцит, имеющий неровную поверхность и "поры" Виден длинный отросток ретикулярной клетки (указано стрелком).

158. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Х200. Слева видна капсула органа, под которой расположена щелевидная полость - краевой синус. От него (вверху справа) отходит в паренхиму внутриузелковый синус. В корковом веществе различимы лимфоциты, ретикулярные клетки.

159. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Вокругузелковый синус. Х200. Видны ретикулярные клетки (указаны стрелками), образующие сеть. На поверхности ретикулярных клеток видны лимфоциты.

160. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Мозговой синус. Х1570. В центре расположена "розетка" - макрофаг (М), взаимодействующий с лимфоцитами.

161. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Х14ОО. Мозговой синус пересекают отростки ретикулярных клеток (указаны стрелками). На их поверхности видны макрофаги (М), взаимодействующие посредством своих отростков с лимфоцитами.

162. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Мозговой синус (идет сверху вниз). Х1600. Вверху слева виден лимфоцит в момент миграции через пласт береговых эндотелиальных клеток; внизу - волосовидные отростки макрофага, связанные с лимфоцитами.

163. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Дистальный отдел мозгового синуса. Х200. В центре видно начало отводящего лимфатического сосуда (Л).

164. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Коррозионный препарат. X150. Видны кровеносные сосуды, входящие в ворота органа.

165. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Х200. Виден переход посткапиллярной венулы (указано стрелкой) в вену мозгового вещества (В).

166. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Коррозионный препарат. Х200 (препарат Л. И. Полянской). Видны петли капилляров, направляющихся к корковому веществу и впадающих в посткапиллярные венулы.

167. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Х200. Виден переход посткапиллярной венулы (указано стрелкой) в вену мозгового вещества (В).

168. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Х1200. Виден продольный скол посткапиллярной венулы, выстланной "высокими" эндотелиоцитами.

169. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Посткапиллярная венула. Х3600. В центре виден мигрирующий через стенку венулы лимфоцит. Эндотелиоциты в этом месте образовали своеобразное отверстие.

170. Брыжеечный лимфатический узел крысы. Вид на эндотелий посткапиллярной венулы со стороны просвета сосуда. Х7500. В центре расположены два лимфоцита, прикрепленные к эндотелиальным клеткам.

171. Красная пульпа селезенки крысы. Х1200. Видны венозные синусы, состоящие из одного слоя палочковидных эндотелиоцитов. Между ними расположены скопления клеток крови - селезеночные тяжи.

172. Скол лимфатического узла селезенки крысы. Х11ОО. В центре виден поперечный скол центральной артерии. Периартериальное влагалище содержит более плотно расположенные клетки, чем краевая зона красной пульпы.

173. Селезенка крысы. Коррозионный препарат. Х205. В центре виден слепок центральной артерии, которую окружает пустое пространство. Центральная артерия посредством прямых фолликулярных артериол связана с краевыми синусами красной пульпы, заполненными инъекционной массой (справа).

174. Селезенка крысы. Коррозионный препарат. Х220. Видны краевые синусоиды, заполненные инъекционной массой. От центральной артерии (А) вниз отходит кисточковая артериола.

175. Селезенка крысы. Коррозионный препарат. Ограниченное введение инъекционной массы. Х190. Пространство между краевыми синусами почти не содержит инъекционной массы. В центре видны венозные синусы, начинающиеся из краевых синусов.

176. Селезенка крысы. Коррозионный препарат. Х150. Пространство между краевыми синусами занято слепками венозных синусов. В центре хорошо видно, что последние начинаются от краевых синусов.

177. Селезенка крысы. Венозные синусы сливаются друг с другом и образуют трабекулярную вену, уходящую вниз и вправо. Х120 (коррозионный препарат Л. И. Полянской).

178. Селезенка крысы. Вид со стороны просвета па палочковидные эндотелиоциты, образующие стенку венозного синуса. X10000.

179. Селезенка крысы. Вид на стенку венозного синуса со стороны адвентициальной поверхности. X10200. Видны поперечные перетяжки, образованные ретикулярными клетками (Р) и ретикулярными волокнами.

180. Селезенка крысы. Поперечный скол начального отдела венозного синуса. X12500. Видны округлые эритроциты (Э), проходящие через стенку венозного синуса.

181. Вилочковая железа кролика. Х30. На сколе видны междольковые перегородки. Дольки не полностью изолированы друг от друга. Вокруг органа
расположена жировая ткань.

182. Долька вилочковой железы кролика. Х200. На сколе видно более компактно расположенное по периферии корковое вещество и мозговое вещество, находящееся в центре.

183. Вилочковая железа крысы. Х1350. На поверхности среза видны тимоциты, эндотелиоретикулоциты и ретикулярные волокна.

184. Вилочковая железа крысы. Х200 (коррозионный препарат Л. И. Полянской). Видны очень тонкие кровеносные капилляры, расположенные в корковом веществе. В мозговом веществе проходят посткапиллярные венулы.

185. Вилочковая железа крысы. Х400 (коррозионный препарат Л. И. Полянской). Видны особенности ветвления артериальных сосудов (в центре). На границе между корковым и мозговым веществом локализованы "течи" инъекционной

186. Вилочковая железа крысы. Х200 (коррозионный препарат Л. И. Полянской). Видны сети капилляров и вен, расположенные параллельно поверхности капсулы. В центре дольки видны "течи" инъекционной массы.

ГЛАВА 6. ЭНДОКРИННЫЕ ЖЕЛЕЗЫ

Гипофиз

Передняя доля гипофиза имеет трабекулярное строение. Под СЭМ на сколе органа видно, что перекладины аденогипофиза состоят из железистых клеток. Трабекулы формируют сплетение, в промежутках которого проходит сплетение микрососудов - широких синусоидов.

Железистые клетки отделены друг от друга хорошо заметными щелями и соединяются друг с другом с помощью отростков (см. рис. 187). В отдельных участках щели расширяются и принимают вид округлых каналов, анастомозирующих друг с другом.

Эндотелиальные клетки, образующие стенки синусоидов, либо тесно прилежат к железистым клеткам (см. рис. 188), либо отделены от них тонкой прослойкой соединительной ткани. В них видны округлые фенестры.

Различить под СЭМ, к какому виду принадлежит та или иная железистая клетка, довольно трудно. Лишь в том случае, когда скол проходит через цитоплазму, по величине гранул и форме клетки с определенной долей вероятности можно идентифицировать ее разновидность. Обычно по наличию округлых гранул легче всего найти соматотропоциты и маммотропоциты (см. рис. 189). Остальные клетки различаются с трудом.

Средняя доля гипофиза состоит из нескольких слоев однородных по строению эпителиальных клеток.

Задняя доля гипофиза содержит нервные и глиальные клетки и под СЭМ ее строение во многом сходно с таковым нервной ткани.

Щитовидная железа

В СЭМ основная структурно-функциональная единица щитовидной железы - фолликул - выглядит как сфера или овоид. Размеры фолликулов широко варьируют. Между фолликулами видны прослойки рыхлой соединительной ткани, содержащей кровеносные и лимфатические микрососуды и нервы (см. рис. 190, 191). Легко различимы околофолликулярные клетки (см. рис. 191).

Со стороны просвета тиреоциты покрыты многочисленными микроотростками и единичными ресничками, располагающимися, как правило, в центре апикальной поверхности клеток (см. рис. 192). Высота тиреоцитов, количество микроотростков и их размеры на апикальной плазмолемме могут изменяться в зависимости от функционального состояния клеток (см. рис. 193). Нередко на апикальной поверхности фолликулярных клеток обнаруживаются шарообразные структуры, которые представляют собой гранулы тиреоглобулина, секрстирующегося по апокриновому типу и не удаленного в процессе препаровки образцов (см. рис. 194). При стимуляции тиреотропным гормоном наблюдается появление ложковидпых псевдоподий, которые служат для реабсорбции тиреоглобулина фолликулярными эпителиальными клетками.

Щитовидная железа - одна из наиболее богато васкуляризированных эндокринных желез. Аминокислоты, йод и другие субстраты поступают к эпителиальным клеткам по кровеносным капиллярам, оплетающим фолликул; через эти же капилляры тиреоидные гормоны, синтезируемые в щитовидной железе, выводятся в общий кровоток. Артериальные сосуды в составе соединительных прослоек подходят к фолликулам (см. рис. 195) со стороны внутренней поверхности, где распадаются на густую однослойную сеть тесно анастомозирующих капилляров, оплетающих каждый отдельный фолликул. Обменные микрососуды разных фолликулов между собой не связаны (см. рис. 196). Капиллярные сети фолликулов впадают в короткие фолликулярные вепулы, которые дренируются межфолликулярными венулами, в свою очередь отдающими кровь в более крупные вены (см. рис. 197). Венозные сосуды идут ближе к наружной поверхности органа.

Лимфатические микрососуды щитовидной железы имеют больший диаметр по сравнению с кровеносными капиллярами и менее извиты. Они не формируют густого сплетения вокруг каждого фолликула. Петли лимфатических капилляров, как правило, охватывают несколько смежных фолликулов.

Надпочечник

На сколе надпочечника в СЭМ отчетливо выявляются два отдела: корковое и мозговое вещество (см. рис. 198). Клубочковая зона коркового вещества надпочечника снаружи прилежит к соединительнотканной капсуле и состоит из групп тесно упакованных клеток, сплетенных сетью капилляров с непрерывным эндотелием (см. рис. 199). Кровеносные капилляры распространяются в пучковую зону, где они приобретают вид прямых синусоидов (см. рис. 200). Клетки клубочковой зоны выглядят слегка вакуолизированными вследствие экстракции липидных гранул в процессе препаровки (см. рис. 200, 201). Степень насыщенности клеток липидными гранулами зависит от функционального состояния и вида животного. Клетки пучковой зоны содержат больше липидов и организованы в виде тяжей, идущих по направлению к мозговому веществу. Длинные прямые синусоидные капилляры, идущие между тяжами, тесно связаны с поверхностью клеток пучковой зоны (см. рис. 201) и выстланы эндотелием фенестрированпого типа. Люминальиая поверхность относительно гладкая и ровная. Фенестрированные области разделяются участками нефенестрированной цитоплазмы (см. рис. 202). В эндотелии кровеносных капилляров надпочечника выделяют четыре вида фенестр с учетом их расположения: а) мелкие, равномерно расположенные; б) мелкие, расположенные группами (кластерами); в) крупные, равномерно расположенные; г) крупные, расположенные кластерами (см. рис. 203, 204). В сетчатой зоне клетки расположены в виде анастомозирующих сетей и окружены синусоидами из сетчатого кровеносного сплетения. Надпочечниковые артерии идут вдоль поверхности надпочечника, ветвясь па артериолы, и затем распадаются на капилляры (см. рис. 205). Кортикальные микрососуды начинаются от капсулярного сплетения и идут вертикально вниз к мозговому веществу. Они часто анастомозируют друг с другом и формируют неизолированные сплетения синусоидов (см. рис. 206). В клубочковой зоне расстояние между анастомозами меньше, чем в пучковой и в ретикулярной зонах. Синусоидные капилляры данного района сливаются в собирательную вену на уровне кортикомедуллярного соединения и затем впадают в надпочечниковую вену в мозговом веществе. На сколе органа в СЭМ видно, что крупные венозные сосуды в мозговом веществе образуют анастомозирующее сплетение. Некоторые ветви артерий из капсулы (3-5 ветвей на каждую надпочечниковую железу крысы) пенетрируют капсулу и идут вертикально вниз в корковое вещество. Эти пепетрирующие артериолы диаметром 20-30 мк проходят через корковое вещество, не давая боковых ветвей, пока не достигают мозгового вещества, где они делятся на капилляры, формирующие рыхлое неизолированное сплетение. Кровь из него собирается в ту же самую венозную систему, которая дренирует корковое вещество. Таким образом, мозговое вещество надпочечника имеет двойное кровоснабжение. В первом случае кровь через пенетрирующие артериолы проходит, не контактируя с клетками коркового вещества, во втором - кровь поступает из синусоидов сетчатой зоны, которые анастомозируют на уровне кортикомедуллярного соединения с кровеносными микрососудами мозговой части. В последнем случае мозговое вещество получает кровь, богатую стероидными гормонами коркового вещества надпочечника.

187. Скол передней доли гипофиза крысы. Х3000. Между эпителиальными клетками видны соединительнотканные прослойки. Смежные эпителиоциты соединены друг с другом выростами. Между тяжами железистых клеток видны кровеносные сосуды - синусоиды.

188. Скол передней доли гипофиза крысы. Х200. Вверху справа виден продольно вскрытый микрососуд - синусоид.

189. Скол передней доли гипофиза крысы. X10000. Видны две поперечно сколотые лютеотропные клетки (ЛК) с гранулами.

190. Щитовидная железа крысы. Х1000. Видны наружные поверхности фолликулов, покрытые коллагеновыми волокнами (KB) и кровеносными капиллярами (КК).

191. Скол щитовидной железы крысы. Х2000. Многочисленные тесно расположенные фолликулы заполнены коллоидом. По их периферии расположены кровеносные капилляры. Между фолликулами видны тонкие прослойки соединительной ткани.

192. Фолликул щитовидной железы кролика (коллоид удален). Х2500. Стенка фолликула образована однослойным кубическим эпителием.

193. Апикальная поверхность щитовидной железы кролика. Х8000. Апикальная поверхность клеток имеет куполообразную форму и покрыта многочисленными невысокими микроворсинками. Наряду с микроворсинками определяются шаровидные гранулы, представляющие собой часть коллоида.

194. Фолликул щитовидной железы кролика. Х5000. Эпителиальные клетки уплощены.

195. Микрососуды щитовидной железы крысы. Коррозионный препарат. Х200 каждый фолликул оплетен однослойной сетью капилляров.

196. Микрососуды щитовидной железы крысы. Коррозионный препарат. Х400. В центре виден фолликул, оплетенный сетью анастомозирующих кровеносных капилляров. Капиллярные сети разных фолликулов, как правило, обособлены.

197. Щитовидная железа крысы. Коррозионный препарат. Х200. Видны венулы (В), дренирующие микрососуды нескольких фолликулов.

198. Поперечный скол надпочечника крысы. Х600. Снаружи видна капсула. Вверху располагается корковое вещество, внизу - мозговое. В последнем проходят крупные венозные сосуды.

199. Клубочковая зона коркового вещества надпочечника крысы. Х5000. Между продольно расположенными балками эпителиоцитов находятся синусоиды. В клетках паренхимы видны шаровидные пустоты, соответствующие расположению жировых веществ - предшественников гормонов.

200. Пучковая зона коркового вещества надпочечника крыс. Поперечный срез через синусоид. X10000. Видны фенестры и микроворсинки. Рядом расположены эпителиальные клетки с жировыми включениями.

201. Пучковая зона коркового вещества надпочечника крысы. Х1500 Видны тяжи железистых клеток, между которыми идут капилляры.

202. Надпочечник крысы. Пучковая зона коркового вещества. Х20000. Стенка синусоида содержит множество пор. Околоконтактные зоны не перфорированы.

203. Надпочечник крысы. Пучковая зона коркового вещества. Х3000. Железистые клетки содержат многочисленные жировые капли, имеющие вид пустот.

204. Надпочечник крысы. Пучковая зона коркового вещества. Продольно вскрытый синусоид. Х5000. В центре видно ядросодержащее возвышение (ЯВ) эндотелиоцита.

205. Микрососуды надпочечника крысы. Х200 (коррозионный препарат Л. И. Полянской). Видно капсулярное капиллярное сплетение. Артериола (А) ветвится и отдает сосуд, пенетрирующий корковое вещество.

206. Микрососуды надпочечника крысы. Коррозионный препарат. Х190. Отчетливо видны различия в характере организации капиллярных сплетений коркового (вверху) и мозгового вещества (внизу). В последнем преобладают синусоиды большого диаметра.

ГЛАВА 7. ОРГАНЫ ПИЩЕВАРЕНИЯ

Пищеварительный тракт

В настоящее время хорошо изучена не только гистология и ультраструктура всех слоев кишечной трубки и желез, относящихся к пищеварительной системе [Иванова И. Ф., Ковальский П. А., 1976; Елисеев В. Г. и др., 1983; Хэм А., Кормак Д., 1982], но и ультраструктура стенки кровеносных и лимфатических капилляров этих органов [Шахламов В. А., 1971; Шахламов В. А., Цамерян А. П., 1982]. С помощью СЭ микроскопии различными исследователями изучена поверхность слизистой оболочки всего желудочно-кишечного тракта.

В настоящее время имеется четкое представление об ультраструктуре и строении поверхности большинства желез, связанных с пищеварительной системой, таких, например, как слюнные железы, поджелудочная железа, печень, а также о эндокринных клетках, связанных с эпителием пищеварительной системы. С помощью СЭ микроскопии исследованы также эпителий губ, языка и других отделов пищеварительной системы. Так, поверхность языка человека покрыта неороговевающим эпителием. Этот эпителий покрывает и различные сосочки передней и задней частей языка (см. рис. 207). Нитевидные сосочки передней части языка имеют конусообразное строение (см. рис. 207 а). Они могут располагаться и на боковой поверхности языка. Грибовидные сосочки (см. рис. 207 б, в) преимущественно располагаются на средней части языка. На поверхности сосочков можно хорошо различить эпителиоциты, часть которых отторгается. На поверхности грибовидного сосочка (см. рис. 207 б) видны отторгающиеся эпителиоциты, а глубже располагаются нормально функционирующие, плотно соединенные между собой эпителиальные клетки. Границы этих соединений видны в виде светлых извитых линий между эпителиальными клетками. При более сильном увеличении (см. рис. 207 г) на поверхности этих эпителиальных клеток видны мелкие, короткие микроворсинки, а границы между клетками имеют плотные соединения типа десмосом. На снимках они представлены в виде светлых бугорков на границе двух клеток. Необходимо отметить, что при сильном увеличении и при СЭ микроскопии все эпителиоциты на любом виде сосочков передней и задней частей языка имеют микроворсинки.

Листовидные сосочки расположены преимущественно на боковой поверхности языка; в СЭМ они видны в виде уплощенных выступов, объединенных между собой по 2-3 у оснований. При рассматривании их сверху они имеют вид листа (из трех лопастей) (см. рис. 207 д). В средней части языка также можно обнаружить единичные листовидные сосочки (см. рис. 207 е).

Сосочки задней части языка имеют особый вид - желобоватый, особенно у корня языка (см. рис. 207 ж). Они отличаются тем, что окружены углублением в виде желоба, поэтому при СЭ микроскопии можно четко различить сферическую часть, основание, желоб и валик, окружающий желоб. Такой сосочек, как и описанные выше, покрыт слущивающимися и нормально функционирующими эпителиоцитами, на поверхности которых видны такие же микроворсинки, как и на других сосочках.

Пищевод человека выстлан многослойным плоским неороговевающим эпителием (см. рис. 208 а). Эти клетки имеют полигональную форму, на их поверхности имеются микроскладки (см. рис. 208 б). При сильном увеличении ветвящиеся складки на поверхности эпителиоцитов хорошо различимы. Они, извиваясь, объединяются, образуя крупные и мелкие гнезда (см. рис. 208 б). Границы клеток четко видны в СЭМ. Они представлены плотными межклеточными соединениями (см. рис. 208 б).

По данным световой микроскопии, желудок покрыт однослойным призматическим эпителием, наиболее типичным в области дна желудка. Инвагинации этого эпителия в собственный слой образуют желудочные ямки, в которые впадают желудочные железы. При СЭ микроскопии общий вид слизистой оболочки желудка представлен в виде пчелиных сот (см. рис.209 а). При более сильном увеличении (см. рис. 209 б) можно
увидеть остатки пищи в желудочных ямках и малые отверстия,
через которые выделяется секрет.

Поверхность слизистой оболочки тонкой кишки (см. рис. 210 а, б, в), в которой заканчиваются все пищеварительные процессы, а молекулы питательных веществ всасываются в лимфатическую и кровеносную систему, при СЭ микроскопии (см. рис. 210 а) представлена в виде удлиненных ворсинок конусообразной формы. Основание ворсинок расширено, апикальная часть вдвое или втрое уже основания. На ворсинках четко видны складки различной глубины, границы этих складок имеют извитой ход. Поверхность ворсинок выстлана высоким призматическим всасывающим каемчатым эпителием. При более сильном увеличении одной ворсинки на складках четко видны границы эпителиоцитов, имеющих полигональную форму (см. рис.210 б). Апикальная часть микроворсинок каемчатого эпителия - шероховатая. При производстве скола поперек стенки тонкой кишки при СЭ микроскопии этого участка максимальное
увеличение позволяет увидеть микроворсинки на их продольном срезе (см. рис. 210 в), а также и другие органеллы не только всасывающих эпителиоцитов, но и бокаловидных клеток. Весьма демонстративным при СЭ микроскопии является свод пейеровой бляшки тонкой кишки (см. рис. 211). Он представляет собой сферу, на которой четко можно различить поверхность маргинальных клеток и призматические эпителиоциты, имеющие микроворсинки. Вокруг свода пейеровой бляшки расположены, тесно прилегая друг к другу, обычные ворсинки тонкой кишки, подробно описанные выше.

Установлено, что через маргинальные клетки к иммунокомпетентным клеткам пейеровой бляшки поступают различные антигены, присутствие которых вызывает в организме различные иммунологические реакции.

Каждая ворсинка тонкой кишки имеет свою систему кровообращения, состоящую из артерии, вен, сети кровеносных и лимфатических капилляров. При наливке кровеносных сосудов специальными смолами и использовании метода приготовления коррозионных препаратов с последующей СЭ микроскопией эту сеть можно четко различить (см. рис. 212).

Толстая кишка у человека и млекопитающих соответственно ее функциональному назначению по сравнению с тонкой имеет свои особенности гистологического строения и соответствующую топографию при СЭ микроскопии. Так, в толстой кишке отсутствуют ворсинки, а слизистая оболочка ее имеет многочисленные складки (см. рис. 213а). При изучении их поверхности можно увидеть границы призматических клеток, имеющих полигональную форму. Эти клетки чередуются с многочисленными бокаловидными клетками, иногда выделяющими в апикальной части слизь. На поверхности тех и других клеток видны апикальные части микроворсинок в виде мелкогранулированных зерен (см. рис.213б).

Печень

На сколе печени в СЭМ видны формирующие ее полигональные дольки, каждая из которых представлена лабиринтом связанных друг с другом печеночных балок. Последние пронизаны системой анастомозирующих полостей, в которых можно вычленить сеть специализированных капилляров - синусоидов и систему желчных канальцев. Печеночные балки по данным СЭ микроскопии образованы, как правило, одним слоем печеночных клеток. К одному ряду печеночных клеток с двух сторон прилежат стенки синусоидов (см. рис. 214).

Каждый гепатоцит контактирует не только с соседними по ряду, по также с выше и ниже расположенными печеночными клетками. Гепатоцит имеет форму многогранника, состоящего из 6 и более граней, существенно различающихся по своему рельефу. Поверхности гепатоцита, обращенные в сторону вокругеинусоидного пространства, покрыты множеством коротких микроворсинок, которые, очевидно, необходимы для реализации всасывательной функции. Билиарные грани печеночных клеток в основном гладкие и лишь в их центре проходят 1-2 билиарные бороздки, участвующие в образовании и составляющие одну из половин поверхности цилиндра желчного канальца. Один гепатоцит может принимать участие в формировании одновременно нескольких желчных канальцев. Билиарные бороздки покрыты микроворсинками (см. рис. 215).

Кровоснабжение. Печень получает кровь из двух источников - воротной вены и печеночной артерии. В органе они многократно ветвятся и на всем протяжении их сопровождают желчные протоки. Подходя к дольке, ветви воротной вены, печеночной артерии и желчный проток образуют так называемую триаду. Междольковые артерии и вены, входящие в состав триад, отдают короткие ветви вокруг дольковых артерий и вен, которые идут по периферии дольки и распадаются на сеть синусоидных сосудов. Как правило, вокругдольковые артерии меньше по диаметру, чем соответствующие вены, и имеют более извилистый ход. Некоторые их тончайшие ветви непосредственно впадают в синусоиды. Артериальные веточки входят в дольку более постепенно под острым углом, переходя на ее периферии в сеть синусоидов.

Отдельные междольковые артерии отдают ветви, идущие к желчному протоку, и формируют сеть капилляров, оплетающую его. Отток крови от перибилиарной капиллярной сети осуществляется в сеть синусоидов через толстые укороченные сосуды. Вставочные сосуды, судя по ядерным отпечаткам, являются сосудами венозного типа. Они могут перед впадением в синусоиды делиться на 2-3 ветви. Перибилиарные капиллярные сети реабсорбируют некоторые компоненты желчи и возвращают их в синусоиды, что, вероятно, регулирует секрецию желчи гепатоцитами по типу обратной связи.

По синусоидам кровь стекает к центральной вене. При этом формируется своеобразная лучистая структура, характерная для хода капилляров в печеночной дольке. Это особенно хорошо видно па коррозионных препаратах микрососудов (см. рис. 217). Перед впадением в центральную вену 2-3 синусоида могут сливаться и формировать общий ствол (см. рис. 218).

Центральная вена является начальным звеном выносящей кровеносной системы печени. Стенка центральной вены имеет множество отверстий, являющихся просветами впадающих в нее синусоидов (см. рис. 219). Центральные вены сливаются чаще под углом, близким к прямому, образуя собирательные или поддольковые вены (см. рис. 220). Последние не сопровождаются артериями и желчными протоками. Собирательные вены сливаются, образуя печеночные вены, которые в свою очередь впадают в нижнюю полую вену.

Синусоиды. Эндотелиоциты синусоидов представляют собой уплощенные клетки, зона перикариона лишь слегка выступает в просвет (см. рис. 221). От ядросодержащей зоны к периферии клетки идут ветвящиеся и постепенно истончающиеся цитоплазматические гребни, которые ограничивают участки периферической цитоплазмы. В истонченных цитоплазматических участках между гребнями видны сильно варьирующие по размерам и численности поры. Часто они образуют скопления - решетчатые пластинки. Через крупные трансэндотелиальные перфорации можно рассмотреть микроворсинки гепатоцитов, расположенные в вокругсинусоидном пространстве. Наличие пор в стенке синусоидов создает благоприятные условия для прямого контакта плазмы с поверхностью печеночных клеток и обмена метаболитов. Установлено, что крупные поры не являются артефактом высушивания, как это предполагалось ранее. Имеются все основания полагать, что число и размеры пор контролируются деятельностью опорно-двигательного аппарата эндотелиоцитов.

В синусоидах печени наряду с эндотелиоцитами располагаются звездчатые ретикулоэндотелиоциты (купферовские клетки). С помощью СЭ микроскопии выявлено их принципиальное отличие от эпдотелиальных клеток. Во-первых, по характеру рельефа они напоминают макрофаги; во-вторых, между эндотелиоцитами и звездчатыми клетками не было обнаружено переходных форм, что отвергает предположение о том, что купферовские клетки - это особое состояние эндотелиоцитов.

Крупные тела звездчатых клеток выступают в просвет синусоида. От тела купферовской клетки отходит множество длинных и тонких цитоплазматических отростков, прикрепляющихся к эпдотелиоцитам. Многие из них проходят над крупными порами в эндотелии. Рельеф клеточной поверхности звездчатых ретикулоэндотелиоцитов образуют многочисленные нерегулярной формы складки, микроворенпки и пузыри. Иногда удается наблюдать также ламеллоподии, распластанные по эндотелию, а также раффлы (см. рис. 222). Купферовские клетки могут локализоваться в вокругеинусоидных пространствах и лишь их цитоплазматическис отростки как бы свешиваются в просвет синусоида. Псевдоподии проходят при этом через крупные и средние поры. Возможно, образование крупных пор является следствием воздействия на эндотелиоцит отростков звездчатой клетки. Купферовские клетки, являясь активными макрофагами, могут свободно перемещаться из кровеносного синусоида в вокругеинусоидное пространство. Они выполняют защитную функцию, кроме того, полностью или частично перекрывая просвет синусоида, они могут функционировать в качестве регуляторов кровотока.

Вокругсинусоидное пространство (пространство Диссе) представляет собой щелевидную полость между эндотелиалыюй стенкой синусоида и плазмолеммой гепатоцитов печеночных балок. Ширина пространства Диссе варьирует обычно от 0,2 до 1 мкм. Нередко от этой щели между гепатоцитами отходят глубокие карманы. Последние могут соединяться друг с другом, формируя разветвленную систему межклеточных полостей, пронизывающих печеночные балки и соединяющих пространства Диссе смежных синусоидов. Вокругсинусоидное пространство сообщается с просветом кровеносных капилляров через поры в эндотелиальной выстилке и заполнено фильтратом плазмы крови. В вокругеинусоидных пространствах обнаруживаются коллагеновые фибриллы и изредка встречаются веретенообразные вокругеинусоидные липоциты. Поверхность их довольно гладкая, имеются лишь единичные микроворсинки. Иногда цитоплазматические выросты этих клеток достигают карманов между соседствующими гепатоцитами. В цитоплазме липоцитов на сколе видно множество жировых капель, которые, как полагают, являются депо жирорастворимых витаминов (см. рис. 223). Отдельные липоциты не содержат жировых капель и напоминают фибробласты.

Билиарная система. Желчь секретируется гепатоцитами в желчные канальцы и движется на периферию классической дольки сначала по мельчайшим внутридольковым желчным протокам, а затем - по междольковым проточкам и протокам, и в конечном счете вливается в два больших печеночных протока. Если плоскость скола проходит по билиарным поверхностям гепатоцитов, желчные канальцы выглядят в виде полигональной сети бороздок (см. рис. 215). Эти полуканальцы расположены в центре билиарной грани ряда печеночных клеток, ход их прямой, и они, как правило, не ветвятся. Лишь в отдельных случаях желчные канальцы бифуркационно делятся на две и более ветви, идущие по билиарной грани печеночной балки. Во многих случаях желчные канальцы отдают ветви, заканчивающиеся недалеко от начала вокругеинусоидного пространства, однако прямых сообщений между пространством Диссе и желчными канальцами нет.

Наличие слепых окончаний желчных канальцев доказывает внутриклеточное образование желчи. Ширина желчных бороздок колеблется от 0,5 до 1 мкм. Микроотростки, образуемые плазмолеммой печеночных клеток, участвующей в образовании канальца, сконцентрированы у краев бороздки. При впадении канальца в проточек просвет слегка расширяется с образованием своеобразного, неправильной формы, мешочка.

Люминальная поверхность проточковых эпителиальных клеток имеет много микроворейнок, сконцентрированных в продольные ряды. Проточки соединяются с междольковыми желчными протоками, эпителиальные клетки которых становятся выше, просвет расширяется, число коротких микроворсинок на поверхности эпителиальных клеток увеличивается, встречаются отдельные реснички, которые участвуют в движении желчи по билиарным протокам и выполняют функцию хеморецепторов. По протокам желчь оттекает в желчный пузырь.

Желчный пузырь

Под СЭМ на внутренней поверхности желчного пузыря обнаруживается два типа складок: крупные, в образовании которых участвует собственная пластинка слизистой оболочки, и мелкие, сформированные клетками однослойного призматического эпителия. Форма крупных складок существенно различается в области дна и шейки пузыря (см. рис. 224, 225).

Апикальная поверхность эпителиальных клеток покрыта множеством микроворсинок средней длины (см. рис. 226). Нередко у отдельных эпителиоцитов встречаются изменения рельефа апикальной поверхности плазмолеммы, соответствующие различным фазам апокриновой секреции (см. рис. 227). Вначале на апикальной поверхности плазмолеммы исчезают микроворсинки и образуется своеобразный апокриновый отросток. Некоторые отростки покрыты длинными раздвоенными микроотростками. Разрыв плазмолеммы апокринового отростка приводит к выделению в просвет капли очередной порции слизи.

Поджелудочная железа

Паренхима железы делится на дольки, окруженные тонкими соединительнотканными перегородками, которые содержат протоки, нервы, кровеносные и лимфатические сосуды (см. рис. 228, 229). С поверхности дольки и ацинусы выглядят как бугристые образования, покрытые сеточкой коллагеновых волокон (см. рис. 228). Каждый ацинус окружен тесно прилежащей к эпителию сетью поддерживающих соединительнотканных волокон. Секреторный продукт ацинарных клеток - гранулы зимогена- четко определяется на поперечном сколе в центральной части эпителиоцитов (см. рис. 230). Вблизи от просвета ацинуса на коррозионных препаратах видны кровеносные капилляры, оплетающие ацинусы (см. рис. 231, 232).

Эндокринная часть поджелудочной железы представляет собой панкреатические островки - скопления клеток, пронизанные сетью апастомозирующих микрососудов синусоидного типа. На сколах цитоплазмы эндокринных клеток полигональной формы видны мелкие секреторные гранулы.