О.В. Мосин

Из вышесказанного следует, что мутагенные реакции связаны с изменениями в последовательности нуклеотидов. Эти изменения могут быть замещением одного или нескольких нуклеотидов другими, удлинением, вычленением, обменом или другими перестройками в последовательности. В то время как некоторые изменения являются летальными, другие могут приводить к образованию жизнеспособных мутантов. При этом простейшее возможное изменение, вызванное замещением всего лишь одного нуклеотида другим внутри неизмененной молекулы является часто мутагенным. Это процесс может быть вызван искусственно или самопроизвольно происходит в природе.

Наиболее известной мутацией является превращение нуклеотида в один из трех других естественно встречающихся нуклеотидов. Химическая реакция этого типа известна в рибонуклеиновой кислоте (РНК), где цитозин посредством дезаминирования может быть превращен в урацил [1] (рис. 1).

Рис. 1. Дезамииирование нуклеотидов азотистой кислотой

Можно ожидать закрепления такого изменения при молекулярной редупликации. Менее прямой путь получения мутаций - изменение нуклеотида в производное, которое не встречается в естественной нуклеиновой кислоте, но которое при редупликации ведет к включению естественного нуклеотида, отличающегося от исходного. Этот тип мутации определяется механизмом редупликации. В нем участвуют как энзиматические реакции, так и структурные отношения между матрицей и продуктом редупликации. Относительно связанной с этим энзиматической специфичности известно очень мало, и поэтому трудно предсказать, какие химические изменения нуклеотидов могли бы тормозить редупликацию.

С другой стороны, структурное отношение между матрицей и продуктом редупликации определено для дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в схеме спаривания оснований по Уотсону и Крику [2] (рис. 2). Следовательно, если редупликация как возможно предсказать, какие изменения будут происходить как таковая не тормозится, то иногда возможно предсказать, какие изменения будут происходить как следствие данной реакции, особенно если один нуклеотид замещен близким аналогом другого. Например, в ДНК цитозин, превращенный в урацил посредством дезаминирования, может вызвать при редупликации включение тимина на его место, а аденин, превращенный в гипоксантин, может приводить к включению гуанина (см. рис. 2).

Рис. 2. Нуклеотидные пары в ДНК, с участием естественно встречающихся оснований - аденина, гуанина, цитозина и тимина и продуктов их дезаминирования - урацила и гилоксантина

Реакции, ведущие к образованию аналогов естественных оснований, могут также быть мутагенными, если они не тормозят редупликацию. В этих случаях специфичность спаривания оснований уменьшается и при редупликации в последовательность вносится неопределенность. Депуринизация при кислых значениях рН [4] представляет пример такого рода.

Мутации могут быть вызваны не только химическими изменениями нуклеиновой кислоты, но также включением в ДНК нуклеотидных аналогов, таких, как 5-бромурацил и 2-аминопурин. Эти аналоги приводят к образованию мутантов вследствие того, что специфичность редупликации понижается [4, 5].

Дезаминирование нуклеиновых кислот in vitro также может быть мутагенным [6]. Это явление было обнаружено для вируса табачной мозаики (ВТМ) и некоторых других систем.

Рис. 3. Лист табака через несколько дней после заражения вирусом табачной мозаики А - 0,3x10-4 г/мл обычного штамма ВТМ. На листе видно много хлоротических повреждений: Б - 0,7x.10-6 г/мл обычного штамма ВТМ, обработанного 1М нитритом натрия в течение 20 мин. при рН 4,2. Кроме хлоротических повреждений, образуются 6 некротических (указаны стрелками), свидетельствующих о мутациях

Вирус табачной мозаики содержит одну молекулу РНК, образующую единую цепь из 6400 нуклеотидов. Молекула изолированной РНК обладает инфекционностью, причем её активность зависит от целостности молекулы, а не от пространственной структуры РНК. Поэтому генетические свойства вируса определяются главным образом линейной последовательностью 6400 нуклеотидов [7].

Инкубация вирусной РНК с азотистой кислотой приводила к дезаминированию гуанина, цитозина и аденина, в то время как сама молекула РНК остается неповрежденной.

Дезаминирование вызывало инактивацию, причем инфекционность уменьшалась экспоненциально со временем обработки азотистой кислотой. Эта кинетическая зависимость первого порядка показывает, что дезаминирование единичных нуклеотидов происходит летально для клетки. Корреляция скорости инактивации со скоростью химического дезаминирования свидетельствует, что один из двух отдельных актов дезаминирования является летальным. Иследователи пришли к выводу, что по крайней мере некоторые из нелетальных актов дезаминирования могут приводить к жизнеспособному потомству с измененной нуклеиновой кислотой и, вследствие этого, измененными генетическими свойствами.

Образование мутантов в результате дезаминирования было показано в экспериментах с местными некротическими повреждениями на яванском табаке [6]. На этом виде растений обычный штамм ВТМ дает хлоротические повреждения в виде диффузных пятен на листьях, тогда как некоторые спонтанные мутанты дают некротические повреждения. При этом случайные спонтанные мутанты или возникающие при заражении этим штаммом давали только два-три некротических повреждения на 1000 хлоротических. Однако если РНК обработана азотистой кислотой, то образуется значительно больше некротических повреждений (рис. 3).

В то время как общее число повреждений уменьшается со временем обработки, вследствие инактивации, относительное количество некротических повреждений возрастает линейно до 25%. Абсолютное количества некротических повреждений, образуемых постоянным количеством РНК, вначале также возрастает линейно со временем обработки, затем достигает максимума, после чего уменьшается вследствие инактивирующего действия азотистой кислоты на мутанты.

Количество некротических повреждений возрастало в 20 раз по сравнению с уровнем их спонтанного образования, тогда как общая инфекционность понижалась при этом в 2,7 раза (до 37%).

Кинетика и линейное возрастание мутантных инфекций в начале реакции, показывает, что дезаминирование одного единственного нуклеотида может быть мутагенным.

Кроме мутантов, производящих некротические повреждения на яванском табаке, учёными было обнаружено множество других мутантов, дающих различные симптомы на растениях-хозяевах.

Полученные данные свидетельствуют, что дезаминирование любого одного нуклеотида приблизительно из 1000 нуклеотидов приводит к образованию мутантов, причем 100-200 из них являются мутантами, вызывающими некротические повреждения ткани листа.

Особый интерес представляет изучение действия дезаминирования РНК на структуру вирусного белка. Учёные [12, 13] изучили мутанты, обнаруживаемые по симптомам, продуцируемым на растениях-хозяевах. При среднем количестве около шести дезаминированных групп на молекулу РНК приблизительно половина мутантов имеет неизмененный белок, а другая половина обнаруживает отличия в структуре белка. Отличие было ограничено замещением одной или в редких случаях двух аминокислот. Из этого сделан вывод, что только часть молекулы РНК является генетическим материалом для вирусного белка, в то время как другие участки имеют функции, заключающиеся в синтезе клеточных ферментов или ингибиторов.

Исследование естественно существующих мутантов и штаммов приводит к подобным результатам: близкородственные мутанты мало отличаются по аминокислотному составу.

Некоторые замены аминокислот в молекуле белка (например, аспарагина в аланин) наблюдались как для спонтанных, так и для индуцированных азотистой кислотой мутантов. Дальнеродственные штаммы могут отличаться многими аминокислотами [13].

Общепризнано, что большинство мутантов, возникающих из обычного штамма ВТМ, обладают меньшей жизнеспособностью,, чем сам ВТМ.

Штамм, который сравним с ВТМ по жизнеспособности, "BTM-dahlemensc" [14], является довольно отдаленным и сильно отличается по структуре белка [13].

Кроме ВТМ, мутагенное действие азотистой кислоты было изучено для вируса полиомиелита [15], фагов Т2 [16], Т4 [4, 17], лямбда-Х174[37], и бактерий [19].

У фага Т2 образование бляшек интактным фагом, обработанным азотистой кислотой, указывало на образование мутаций. Возрастание количества мутантов со временем обработки показывает, что единичные акты дезаминирования мутагенны. Поскольку ни один из продуктов дезаминирования не является естественным нуклеотидом ДНК, очевидно, образование аналогов может вызвать мутацию.

Согласно схеме редупликации Уотсона и Крика, дезаминирование гуанина в ксантин не может быть мутагенным, в то время как дезаминирование цитозкна и аденозина может приводить к образованию мутантов (см. рис. 1 и 2).

Эта концепция была проверена экспериментально учёными [20, 21]. Наблюдались различия в зависимости скоростей дезаминирования от рН для трех указанных оснований. Если соотношение скоростей при рН 4,2 и 5,0 для гуанина равно 35, -для аденина и цитозина оно достигает. 90. Соотношение скоростей мутаций равно при этом 90, как для скоростей дезаминирования аденина и цитозина. Дезаминирование гуанина не мутагенно, в то время как дезаминирование цитозина или аденина может приводить к образованию мутантов [20].

Другие исследователи [22] открыли, что азотистой кислотой могут вызываться как прямые, так и обратные мутации. Согласно схеме спаривания оснований, превращение цитозииа в урацил в одном тяже, ведущее к тимину, может быть обращено превращением комплементарного аденина в гипоксантин в другой цепочки молекулы РНК, -что приведет к гуанину, и наоборот (см. рис. 2). Дезаминирование как цитозина, так и аденина мутагенно. Кроме того, первоначальное химическое изменение одного нуклеотида приводит при редупликации к замещению только одного нуклеотида.

Дезаминирование фага лямбда XI74, содержащего одноцепочечную ДНК, мутагенно [17], что доказано появлением на хозяине ряда бляшек. По кинетике это - также реакция первого порядка.

Для трансформирующего начала инактивирующее действие дезаминирования было изучено Замснхофом [23] еще в 1953 г. Мутагенные эффекты были описаны Литманом и Эфрусси-Тейлор [18]. Если исходную ДНК пневмококков обработать азотистой кислотой, то она обнаруживает устойчивость по отношению к таким агентам, как аминоптерин. Хотя уровень трансформации значительно выше, чем в необработанных контролях, кинетика оказывается более сложной, чем простой тип однозамещённой реакции для БТМ, Т2 и 0X174, и эти результаты в настоящее время не объяснены окончательно.

Имеется более чем один механизм, посредством которого последовательность нуклеотидов в генетическом материале определяет биохимические свойства клетки. Известно, что в то время как некоторые гены определяют структуру белков, другие ответственны за синтез ферментов или ингибиторов, определяющие количества и условия синтеза белка [24].

Наиболее основательно изучена структура кодируемых белков. Каждая аминокислота определяется специфической последовательностью нуклеотидов. Эта основная гипотеза кодирования подтверждается результатами, полученными по изучению мутаций и показывающими, что изменение одного нуклеотида может вести к замещению в белке одной аминокислоты на другую. Специфичность такого замещения продемонстрирована трехбуквенным кодированием.

Каждая аминокислота определяется последовательностью трех нуклеотидов из четырех различных типов: аденина (А), гуанина (Г), цитозина (Ц) и урацила (У). При этом возможно существование 64 таких нуклеотидных триплетов (рис. 4).

Дезаминирование может вызывать превращение Ц в У и, возможно, А в Г.

Конечно, не все 380 замен между 20 аминокислотами могут быть вызваны дезаминированием. Ведь код может быть "вырожденным", когда несколько триплетов определяют одни и те же аминокислоты. В этом случае может существовать до 96 возможных замен аминокислот. Если код не вырожденный, то только 20 из всех возможных триплетов определяют по одной аминокислоте каждый, тогда как остальные 44 триплета не имеют смысла, так как переходы, дающие в результате эти триплеты, препятствовали бы образованию белка. Если выбор 20 триплетов произведен наугад, то возможно примерно 9 переходов.

Рис. 4. Замены, полученные посредством дезаминирования, в триплетных кодах А - аденин; Г - гуанин; Ц - цитозин; У - урацил. Стрелки указывают переходы, вызванные дезаминврованием отдельных нуклеотидов, при допущении, что дезаминиройание дает в результате замещение ЦУ и АГ.

Характер замен, являющихся результатом изменения отдельных нуклеотидов специфическими мутагенами специфичен для каждой схемы кодирования.

Все вышесказанное ограничивалось мутациями, возникающими вследствие замещения единственного нуклеотида в генетическом материале. Эти мутации, вызывающие определенные изменения в первичной структуре белков играют существенную роль в процессе эволюции.

Однако маловероятно, что только эти мутации ответственны за эволюцию того великого множества белков, которое существует в клетке.

Трудно себе представить, что крупный функциональный белок мог возникнуть в результате отдельных несвязанных изменений беспорядочной последовательности нуклеотидов.

Точно так же трудно себе представить, что беспорядочное одновременное изменение многих нуклеотидов в гене могло бы привести к образованию нового функционального белка.

Современные исследования показали, что это возможно. Сейчас представляется вероятным, что изменения, возникающие в результате мутаций составляют важные эволюционные процессы на молекулярном уровне.

ЛИТЕРАТУРА

1 Н Schuster, G. Schramm. Z. Naturlorsch., 1958, 13b, 697.

2. J. D. Watson, F. H. C. Crick. Nature, 1953, 171, 737.

3. M. J. В e s s m a n, I. R. L e h m a n,. I. A d 1 e r, S. B. Z i m mermann, E. S. Simms, A. Kornberg. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1958, 44, 633.

4. E. Frees e. Brockhaven Sympos. in Biology, 1959, 12, 63.

5 E. Ф p и 3. Труды V Международного биохим. конгресса. М., Изд-во АН СССР, 1962.

6 К- W. Mundry, A. Gierer. Z. Vererbungslehrc, 1958, 89, 614;

7 A. Gierer, К. W. Mundry. Nature, 1958, 182, 1457.

8 A. Gierer. Progr. Biophys., 1960. 10, 300; Nature, 1957, 179, 1297.

9 K. W. Munrdy. Z. Vercrbungslehre, 1957, 89, 614.

10 F. C. Bawd en. Nature, 1959, 184, 27.

11 K. W. Munrdy. Virology, 1959, 9, 722.

12 A Anderer, H. Uh1ig, E. Weber, G. Schramm. Nature, 1960, 186, 922.

13 G. Melchers. Naturwissenschaften, 1942, 30, 48.

14 W. Vielmetter, С. M. W i e d e r. Z. Naturforsch., 1959, 14b, 312.

15 I. T e s s m a n. Virology, 1959, 9, 375.

16 R. M. Liitnran, H. Ёphrussi-Тау1оr. Acad. sci., 1959, 249, 838.

17 F. Kaudewltz. Z. Naturforsch., 1959, 14 b, :528.

18 W. Vielmetter, H. Schuster. Z. Naturforsch., I960, 15, 304.

19 H. Schuster. Z. Naturlorsch., I960, 15, 298.

20 S. Zamenhof, H. E. A 1 ex a n d e r, G. L e i d y. J. Exp. Med., 1953, 98. 373.

21 A. B. Partiее, F. Yасоb, J. Mоnоd. J. Molecular Biol., 1959, 1, 165.

22 F.H.C. Crick, J. S. Griffith. Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 1957, 43, 416.

23 G. Brannitzer, B. L i e b о 1 d, R. M u 11 e r, Z. phys. Chem., 1960, 320, 170; см. также Труды V Международного биохим. конгресса. М., изд-во АН СССР, 1962.

24 V. M. Ingram. Biochim. et biophys. acta, 1958, 28, 539.