О.В. Мосин.

Эта статья посвящена азам генной инженерии для начинающих биотехнологов-исследователей. Попытаемся дать определение термина генная инженерия. Генная инженерия, или техника рекомбинантных ДНК,-это совокупность приемов, позволяющих исследователю путем операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (который принято называть источником генов) в другой (называемый хозяином или реципиентом) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (например, от человека или животного - бактериям, растениям и др.). В генной инженерии широко используются подходы и методы современной биотехнологии.

В самом общем виде принцип генной инженерии показан на рисунке 1 на примере плазмиды из E. Cоli pBR322. Делается это так. В какой-либо из заранее выделенных репликонов хозяина вводят in vitro нужный ген из другого источника. Полученную таким образом рекомбинантную молекулу, сохраняющую свойства репликона, снова внедряют в клетку-хозяина, в которой он будет реплицироваться и стабильно передаваться клеткам-потомкам при последующем клеточном делении.

Рис. 1. Общий принцип генной инженерии.

Для реализации этой идеи требуется соответствующий репликон, который может легко выделяться, сохранять свои свойства и способен внедряться в клетку после введения в него чужеродной ДНК и, что наиболее важно - стабильно наследоваться. Репликоны, предназначенные для введения чужеродных ДНК в клетки, биотехнологи называют векторами экспрессии.

Приступая к клонированию, в распоряжении биотехнолога-исследователя должны быть способы соединения исходных генов с вектором и введения рекомбинантных репликонов в клетку-хозяина. Необходимо также уметь отличать клетки, содержащие рекомбинантный репликон, от исходных реципиентных клеток.

После введения нужного гена в реципиентную клетку задачи в зависимости от поставленной цели могут быть различными. Иногда оказывается достаточным просто внедрить чужеродный генетический материал, в более сложном случае требуется осуществить его экспрессию в новом хозяине.

Методы решения всех этих задач рассмотрим на примере наиболее хорошо изученного реципиента - кишечной палочки Е. coll. Но сначала рассмотрим способы соединения фрагментов ДНК, используемые в генной инженерии: Многие рестрикционные эндонуклеазы, расщепляя ДНК, дают липкие концевые фрагменты типа EcoRI, HlndlH, BamHI, Sail, PstI и др. При расщеплении одной и той же рестриктазой различных ДНК образуются одинаковые липкие концы и полученные фрагменты соединяются друг с другом по этим концам ДНК-лигазой (рис. 2). Различные ДНК могут быть соединены при помощи ДНК-лигазы и по тупым концам.

Рис.2. Расщепление молекул ДНК рестриктазой BamHI и соединение полученных фрагментов ДНК-лигазой.

Для обеспечения возможности расщепления рекомбинантных ДНК по местам соединения вектора и вставки используются также специальные приемы, наиболее распространенным из которых является метод линкеров.

Нередко применяется так называется коннекторная техника получения рекомбинантных ДНК. Она заключается в том, что с помощью концевой нуклеотидилтрансферазы к З-концу одного фрагмента присоединяется гомополинуклеотид, например поли(dТ) или поли(dС), а к З'-концу другого фрагмента - полинуклеотид, комплементарный используемому в первом случае, т. е. поли(dА) или поли(dС) (рис. 3). При добавлении фрагментов друг к другу они комплексуются за счет образования комплементарных пар оснований между концевыми гомополинуклеотидами, а затем соединяются в клетке-хозяине с помощью ее ферментативного аппарата.

Рис 3. Соединение двух фрагментов ДНК коннекторным методом.

Теперь рассмотрим векторы, используемые в Е. coli - плазмиды и бактериофаги: Молекула вектора должна отвечать определенным требованиям: быть небольшой, содержать уникальные участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами, иметь маркеры для оптимальной селекции рекомбинантных клеток. В качестве векторов для включения чужеродной ДНК в клетки Е. coli используются плазмиды (термин предложен Дж. Ледербергом) и бактериофаги. И те и другие являются репликонами.

Многие плазмиды, представляющие собой двух цепочечные кольцевые молекулы ДНК, содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов и т. д.

Если основная бактериальная ДНК имеет длину около 5-106 п. о., то размеры плазмид составляют всего несколько тысяч пар оснований. Они легко выделяются и очищаются.

Специально сконструированы векторные плазмиды, позволяющие отличать клетки, содержащие рекомбинантные молекулы, от исходных бактериальных клеток. В качестве примера на рисунке 4 приведена плазмида pBR322, которая содержит два гена, программирующие устойчивость к двум различным антибиотикам - тетрациклину (ген tet) и ампициллину (ген blа). В гене let находятся уникальные участки расщепления рестриктазами Hindlll, BamHI и Sail, а в гене bla - участок расщепления Pstl. Если "разрезать" плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепления которой находится в гене tet, и соединить ее методом липких концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной рекомбинантной молекуле останется нетронутым только ген blа, а ген tet утрачивает свою активность, поскольку его последовательность разрывается вставкой. Наоборот, при разрезании плазмиды рестриктазой PstI и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактивируется ген bla тогда как ген tet продолжает обеспечивать синтез белка, придающего Е. coli устойчивость к тетрациклину. Использование такой методологии позволяет быстро идентифицировать клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды.

Рис. 4. Плазмида pBR322

Применение подобного приема показано на рисунке 5. Расщепление исходной плазмиды pBR322 по сайту BamHI и последующее лигирование с фрагментом ДНК приводит к смеси исходных и рекомбинантных плазмид. При введении этой смеси в Е. coli образуются клетки трех типов - не содержащие плазмиду, содержащие исходную pBR322 и клетки с рекомбинант-ной плазмидой. Их легко отличить по различной устойчивости к антибиотикам.

Рис. 5. Техника использования плазмиды pBR322для отбора рекомбинантных клеток

Целевую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках Е, coli, например в бактериофаги. Из множества известных фагов чаще всего в качестве векторов используют сконструированные производные фага К и фагов М13 и fd.

Большое разнообразие векторов существует на основе бактериофагов , в них используется особенность фага, состоящая в том, что значительная часть его ДНК не нужна для размножения фага в клетке (рис. 6). Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага при использовании его в качестве вектора, причем длина вставляемого фрагмента может быть существенно больше величины фрагмента, встраиваемого в плазмиду.

Рис.6. Упрощённая генетическая карта фага-лямбда (зачерченный участок соответствует генам, несущественным для размножения фага)

Важную группу векторов, широко используемых при установлении первичной структуры ДНК, составляют нитевидные бактериофаги, такие, как М13, fd и fl. Фаг М13 представляет собой одно-цепочечную циклическую ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одно цепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (RF), которая во всех отношениях подобна плазмиде. Кроме того, фаговая ДНК содержит короткий участок (500 нуклеотидов), названный межгенной последовательностью (МП), несущественный для ее жизнеспособности (рис. 7).

Рис.7. Фаг М113

Таким образом, выделив репликативную форму ДНК и расщепив ее в области несущественного участка, можно с помощью лигазы вставить в место разрыва чужеродную ДНК. Введение рекомбинантной двухцепочечной молекулы в клетку Е. coli приводит к ее репликации, синтезу (+) -цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделению фага в среду. Далее инфицированная нитевидным фагом клетка, продолжая делиться, хотя и с замедленной скоростью, постепенно выделяет в окружающую среду большое количество фага. Этот фаг содержит в вирионе одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужеродной ДНК.

Теперь рассмотрим трансформацию, трансфекцию, клонирование и селекцию. Трансформацией называется процесс введения плазмиды в клетку, вызывающий наследственные изменения в ней. Процесс инфекции клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, называется трансфекцией. Практически наиболее общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий хлористым кальцием их мембрана становится проницаемой для ДНК. Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку низка. Для плазмид типа pBR322 можно получить 10б - 107 трансформантов при добавлении 1 мкг плазмиды к обработанным хлористым кальцием клеткам, т. е. из каждых 104 - 105 плазмид в клетки попадает только одна. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы выполняется в процессе клонирования. Операция заключается в посеве бактериальной суспензии определенной концентрации на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри таким образом, чтобы на 1 см2 поверхности приходилось 5 - 10 бактерий. Бактериальная клетка, попавшая на поверхность агара, начинает делиться, и в конечном счете в точке локализации образуется семейство ее потомков в виде маленькой колонии, по внешнему виду похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном. Каждая клетка исходной суспензии образует свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Если в качестве вектора служит плазмида pBR322, то для отбора бактерий-трансформантов используют добавление в питательный агар антибиотика - ампициллина или тетрациклина, в зависимости от того, какой из генов, bla или tet, остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют только клетки с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносится на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этой чашке Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду pBR322, а рекомбинантные бактерии клоны не образуют. После такой идентификации рекомбинантные клоны могут применяться для дальнейшего анализа. Отбор по определенному биологическому признаку, в частности по устойчивости к антибиотику, называется селекцией.

Клонирование при использовании в качестве векторов бактериофага X осуществляется следующим образом: к суспензии бактерий, обработанных хлористым кальцием добавляется ДНК фага и осуществляется посев на чашку Петри с питательным агаром так, чтобы на 1 см2 поверхности попадало 5 - 10 клеток с проникшей в них ДНК фага. Клетки, не содержащие ДНК фага, размножаются на агаре и дают мутный ровный "газон", заполняющий всю поверхность чашки. Однако в тех точках, куда попали бактерии с ДНК фага, остаются прозрачные круглые просветы, называемые бляшками или негативными колониями. Образование бляшек связано с тем, что ДНК фага реплицируется в клетке и дает зрелые фаговые частицы. Затем фаговые частицы попадают в среду, заражают окружающие клетки и разрушают их. В результате каждая бляшка состоит из потомков фагов, содержащих одну и ту же ДНК - копию ДНК, попавшей в клетку.

Фаги типа М13 не дают негативных колоний, поскольку они не разрушают клетки. Однако в месте их размножения клетки Е. coli замедляют деление, что приводит к появлению на общем мутном газоне более прозрачных бляшек. Способы селекции основаны либо на том, что в несущественную область фага (МП) вводят ген, программирующий устойчивость к антибиотикам и разрушающийся при внедрении в него чужеродной ДНК, либо на различии цветных реакций, даваемых клетками, зараженными исходным и рекомбинантным фагами.

Следующий важный момент - получение ДНК для клонирования. ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК или путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикционной эндонуклеазой.

При обратной транскрипции эукариотической мРНК чаще всего используется тот факт, что на ее 3-конце обычно содержится поли (А)-последовательность, благодаря которой в качестве затравки для обратной транскрипции можно применять олиго(dТ). На первой стадии обратная транскриптаза синтезирует одноцепочеч-ную ДНК, комплементарную мРНК. Эта ДНК обычно содержит на З-конце "шпильку". После удаления РНК обработкой щелочью или РНКазами образуемая о дно цепочечная ДНК служит затравкой-матрицей для фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, который при наличии четырех dNTP достраивает вторую цепь. В результате образуется шпилечная структура, превращаемая в истинную двух-цепочечную кДНК обработкой Si-нуклеазой (рис. 8).

Далее полученную кДНК можно встроить в соответствующий вектор с помощью линкеров или коннекторной техники.

Рис.8. Подготовка ДНК к клонированию

Следующим этапом является идентификация клонов. Если вставка содержит гены, способные к экспрессии в новом хозяине, рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку, для чего используют методы гибридизации. Бактериальные (или фаговые) колонии выращиваются на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой (рис. 9). После этого приготавливаются так называемые реплики - к фильтру с исходными колониями прижимается свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносится на чашку Петри с плотной питательной средой, где на нем образуются колонии, идентичные первым.

Рис. 9. Поиск рекомбинантных клонов методом радиоавтографии

Далее фильтр-реплику подвергают щелочной обработке, клетки в колониях подвергаются лизированию, и денатурированная ДНК из клеток связывается с нитроцеллюлозой в том месте, где была расположена соответствующая колония. Если в распоряжении исследователя имеется радиоактивная (фосфор-32- или иод-235) меченная ДНК или РНК, комплементарная требуемой вставке, то при выдерживании фильтра в растворе, содержащем радиоактивный полинуклеотид, последний гибридизуется с комплементарными последовательностями. В результате те части фильтра, в которых находились рекомбинантные клоны с требуемой вставкой, оказываются радиоактивными и идентифицируются радиоавтографически.

Радиоактивные "пробы" получают химическим синтезом (в тех случаях, когда известна последовательность искомой вставки или белка, который она кодирует), выделением индивидуальных или сильно обогащенных мРНК с последующим их иодированием изотопом иода-125, а также ферментативным синтезом соответствующих кДНК с использованием фосфор-32 меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Описанная схема экспрессии чужеродных генов довольно проста, но практике довольно часто возникают следующие проблемы. При включении бактериальных генов вместе с их регуляторными участками в Е. coli они, как правило, экспрессируются, давая мРНК и белок. Это происходит потому, что в сигнальных последовательностях, управляющих транскрипцией и трансляцией в различных прокариотических организмах, много общего. Однако экспрессия генов эукариот в бактериях наблюдается очень редко, если не создавать специальные условия. Регуляторные сигналы эукариот сильно отличаются от регуляторных сигналов бактерий и не узнаются бактериальными РНК-полимеразами и рибосомами. При клонировании не кДНК, а геномной ДНК эукариотической клетки экспрессия не происходит, поскольку в бактериальной клетке отсутствует система "сплайсинга".

Поэтому для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая к ДНК или синтетическая ДНК, содержащая кодирующую последовательность, присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии - промотору и рибосом-связывающему участку.

Иногда присоединение ведется таким образом, что кодирующая часть эукариотического гена присоединяется к кодирующей части бактериального гена так, чтобы сохранялась "рамка" считывания. В последнем случае образуются гибридные белки, содержащие в N-концевой части бактериальный белок или его часть, а в С-концевой части - эукариотический белок. Примером использования такого способа экспрессии является получение гонадотропного гормона соматостатина в клетках Е. Coli, проделанная К. Итакурой и Г. Бойером. Аминокислотная последовательность этого гормона была известна биотехнологам, и исходя из нее, согласно генетическому коду, была выведена структура соответствующего искусственного гена. После этого был осуществлен его синтез: ген содержал на N-конце кодон АТС, кодирующий метионин, и липкий конец, соответствующий расщеплению рестриктазой EcoRI AATT, а на С-конце - два стоп-кодона (рис. 10). Этот фрагмент ДНК был присоединен к фрагменту гена бета-галактозидазы Е. coli, содержащему в С-концевой части участок расщепления EcoRI, и вместе со своим промотором и оператором был встроен в плазмиду pBR322. В результате такого соединения получен гибридный ген, в котором С-концевая часть гена бета-галактозидазы заменена "геном" соматостатина. Между геном (бета-галактозидазы и собственно геном соматостатина находится кодон метионина.

Рис.10. Получение гонадотропного гормона соматостатина через гибридный белок -бета-галактозидазу

Транскрипция и трансляция этого гибрида осуществлялась за счет использования соответствующих сигнальных последовательностей бета-галактозидазы. В результате образовался химерный белок, в котором соматостатин отделен от галактозидазной части остатком метионина. Поскольку соматостатин не содержит метиониновых остатков, то при расщеплении химерного белка бромцианом соматостатин был отделен в виде целого пептида. Такой способ экспрессии используется, когда возможно отщепление экспрессируемого пептида от N-кон-цевой части химерного белка или когда достаточно получить гибридный полипептид, например в случае получения искусственных вакцин, где достаточно наличия необходимых антигенных детерминант.

Для получения белков, содержащих более 150 аминокислот, чаще используется прямая экспрессия соответствующих генов, в результате которой сразу синтезируются требуемые белки лишь с незначительной модификацией. При этом кодирующая часть гена соединяется с бактериальным промотором, рибосомсвязывающим участком и инициирующим кодоном АТС.

Именно таким образом получены штаммы Е. coli, продуцирующие гормон роста человека, интерфероны человека и другие белки, имеющие большое практическое значение. Присоединение к кодирующей части гена инициирующего кодона необходимо для обеспечения инициации трансляции. Это приводит к тому, что N-концевая часть синтезируемых таким способом полипептидов отличается от природных присутствием N-концевого формилме-тионина. Клеточные ферменты частично удаляют ее, однако часть синтезируемого белка все же сохраняет модификацию. Во многих случаях такая модификация не меняет физиологических свойств продукта, но при получении лекарственных препаратов необходимо учитывать возможный ее эффект.

В последующем перед биотехнологом-иследователем стоит вопрос идентификации экспрессирующих рекомбинантных генов. Следует подчеркнуть, что метод идентификации экспрессирующих клонов зависит от свойств продукта экспрессии. Если этот продукт обладает собственной биологической активностью, то он может быть идентифицирован по ее проявлению. Например, если экспрессии подвергается ген, кодирующий фермент, то клоны идентифицируют по наличию в них соответствующей ферментативной активности; клоны, синтезирующие интерферон,- по противовирусной активности клеточных экстрактов и т. д.

Рис. 11. Иммунохимическая идентификация экспрессирующих клонов

Однако наиболее общими являются методы иммунохимического анализа, применимые как в случае прямой экспрессии, так и при синтезе гибридных белков.

Существует много вариантов иммунохимического анализа. Один из наиболее распространенных заключается в следующем. На диске из поливинилхлорида сорбируются немеченые антитела к исследуемому белку. Колонии прямо на чашке Петри лизируются и разрушаются в мягких условиях, и поливинилхлоридный диск вводится в контакт с поверхностью чашки. Продукты с антигенными детерминантами исходного белка образуют комплексы антиген - антитело с антителами, сорбированными на диске только в местах положения экспрессирующих клонов. Затем диск отмывается от неспецифически сорбированного антигена и обрабатывается раствором с меченными (радиоактивно, флуоресцентно или иммуноферментно) антителами. Эти антитела образуют комплекс с антигеном за счет его других антигенных детерминант, в результате чего участки диска, содержащие первый комплекс антиген - антитело, оказываются мечеными (рис. 11). По положению меченых участков на диске легко идентифицировать экспрессирующие колонии.

В заключение рассмотрим как протекает процесс клонирования в различных организмах. В настоящее время разработаны системы клонирования в различных бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Наибольший интерес с практической точки зрения представляют системы клонирования в грамположительных бактериях, многие из которых являются промышленно используемыми, а также в дрожжах и клетках высших организмов.

Обычно векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, которые могут существовать и в Е. coli, и в той клетке-хозяине, для которой они предназначены. Это достигается созданием гибридных векторов, содержащих реп-ликон какой-либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон, например плазмиды В. subtilis или дрожжей, что позволяет проводить первоначальное клонирование и отбор требуемых генов в хорошо изученной системе Е. coli, а затем уже вводить выделенные рекомбинантные плазмиды в новый организм.

Такие векторы должны содержать в себе ген или гены, придающие клетке-хозяину легко тестируемый признак, например устойчивость к антибиотикам.

Клонирование в грамположительных бактериях. Наиболее широко используются методы клонирования в В. subtilis и стрептомицетах. Разработка систем векторов для В. subtilis основана на способности плазмид Staphylococcus aureus, несущих гены устойчивости к антибиотикам, к репликации и стабильному наследованию в сенной палочке. Для этих целей гибриды таких плазмид с плазмидами Е. coli широко используются в качестве векторов для В. subtilis. Рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяются в биотехнологии в качестве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов для клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp2 из Streptomyces coelicolor. На основе этой и подобных плазмид в настоящее время сконструированы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость, например, к таким антибиотикам, как метиленоми-цин А.

Клонирование в дрожжах. Наиболее широко используются штаммы Saccharomyces cerevisiae. Работа с дрожжами облегчается тем, что, подобно бактериям, они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой, генетически хорошо охарактеризованы и имеют сравнительно короткое время генерации. S. cerevisiae содержит плазмиду Scpl, представляющую собой циклическую молекулу длиной 2 мкм. Ее гибриды с плазмидами Е. coli обычно и используют в качестве векторов. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных такими рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, лишенной какого-либо питательного компонента. Векторная плазмида, в свою очередь, содержит ген или гены, которые при попадании в клетку придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде.

Поскольку дрожжи представляют собой эукариотический организм, можно было бы ожидать, что гены различных эукариот, в том числе и те, которые содержат интроны, будут корректно экспрессироваться в дрожжевых клетках. Однако это не так. Например, экспрессия генов глобина кролика в дрожжах не происходит благодаря некорректности транскрипции и последующего "сплайсинга" РНК. Тем не менее, применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Такие клетки, подобно В. subtilis, секретируют значительное количество белков во внеклеточную среду, что используют также для секреции чужеродных белков. С этой целью к экспрессируемому гену присоединяется участок, кодирующий сигнальный пептид, обусловливающий секрецию и отщепляемый в ее процессе. В результате в клетке синтезируется белок, содержащий на N-конце сигнальный пептид. Этот белок секретируется в окружающую среду. Таким образом были получены, например, штаммы дрожжей, секретирующие интерферон человека.

Клонирование в клетках животных. Проблема клонирования в клетках животных имеет большое значение для исследования функционирования генов высших эукариот. Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Один из путей включает в себя кон-трансформацию клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Примером являются клетки мыши, дефектные по синтезу тимидинкиназы (ТК ~-клетки). Клетки трансформируются фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген тимидинкиназы, и после трансформации приобретают способность к синтезу фермента, т. е. становятся ТК+-клетками. Клетки ТК+ легко отличаются от ТК-, поскольку они способны расти на средах с аминоптерином (блокирующим определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином,

Следовательно, при конструировании котрансформирующих векторов для трансформации клеток животных используются гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Предварительно клонирование и идентификация генов проводятся в клетках Е. coli и затем рекомбинантная плазмида вводится в ТК--клетки. Среди образовавшихся ТК+-трансформантов отбираются нужные, например путем идентификации продуктов экспрессии клонированных генов.

Другой путь введения клонированных генов в эукариотические клетки аналогичен применяемому в случае Е. coli, когда в качестве векторов используют бактериофаги. В качестве таких эукариотических векторов служат некоторые вирусы. Во многих из них существуют области для литического роста, которые могут быть заменены на чужеродные ДНК. Такие вирусы реплицируются в клетке-хозяине, экспрессируя чужеродные гены. Однако в вирусах животных размеры несущественных областей малы и не позволяют внедрить большие фрагменты ДНК. Некоторые гены животных имеют большие размеры (например, ген дигидрофолатредуктазы мыши - 42 тыс. нуклеотидных оснований). В большинстве случаев чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы теряют способность к репликации. Для ее обеспечения используют вирусы-помощники, синтезирующие продукты недостающих генов. В присутствии помощников рекомбинантный вирус существует за счет этих продуктов. Примером вирусов, применяемых в качестве векторов, является вирус SV-40, геном которого представляет собой циклическую ДНК длиной 5243 нуклеотидных оснований с полностью известной последовательностью. Эукариотические векторы, использующие вирусы, способные формировать вирионы, обладают тем недостатком, что они убивают клетку-хозяина при своем размножении так же как и бактериофаги. Поэтому постоянно делаются попытки разработать векторы, подобные плазмидам. Обычно опухолевые вирусы, в том числе и SV-40, внедряют свою ДНК в хромосому клетки-хозяина. Однако вирус бычьей папилломы в трансформированных клетках существует в виде эписомы (около 100 копий на клетку) и используется в качестве основы для создания эписомных векторов.

Высокий темп исследований генной инженерии на клетках животных вселяет надежду, что в ближайшее время будут разработаны простые системы, которые позволят осуществить анализ механизмов экспрессии генов эукариот и дадут возможность создать животных, обладающих заданными свойствами.

Генная инженерия растений. Эта отрасль генной инженерии не так хорошо разработана, как в случае животных и тем более микробных клеток. Однако в настоящее время она привлекает очень большое внимание, поскольку открывает новые перспективы в растениеводстве. Обычная селекция новых сортов - процесс медленный, и кроме того, она ограничена природными видовыми барьерами. Введение новых генов с помощью техники рекомбинантных ДНК в растения могло бы ускорить этот процесс и существенно расширить его возможности. Кроме того растения обладают существенной особенностью: целое растение может быть выращено из отдельной клетки. Это не относится в равной степени ко всем растениям, например, клетки злаковых или бобовых только очень редко претерпевают такую редифференциацию, тогда как клетки табака, томата или моркови, как показала практика, подвергаются редифферен-циации сравнительно легко.

При растворении целлюлозной стенки растительной клетки ферментамицеллюлаза ми образуются протопласты, в которые легко проникают макромолекулы, в том числе ДНК. Две различные клетки в виде протопластов соединяются с образованием гибридного протопласта - соматической гибридной клетки. Протопласты способны восстанавливать клеточную стенку и далее давать целое растение. Растение может быть получено из протопластов, включивших чужеродную ДНК, или из гибридных протопластов.

При наличии методов введения в растительные клетки определенных генов, способных к функционированию и стабильному наследованию, открываются реальные возможности создания растений с заранее заданными полезными признаками. Векторы для введения генов в растительные клетки могут быть основаны на репликонах растительных вирусов, однако до настоящего времени попытки получения таких векторов, удовлетворяющих, в частности, требованию стабильного наследования, были не очень успешны.

Наибольшее развитие получили векторы, сконструированные на так называемых Ti-плазмидах бактерий Agrobacterium tumefaciens. Эти бактерии инфицируют двудольные растения и вызывают образование корончатых галлов - своеобразных опухолей растений, клетки которых способны размножаться в культуре без добавления факторов роста. Было показано, что такая трансформация является следствием внедрения в геном растения части Д НК-ТЦtumor-inducing) -плазмиды, получившей название Т (transforming)-ДНК. Трансформированные клетки приобретают способность синтезировать необычные аминокислоты - опины, например, нопалин или октопин, являющиеся производными аргинина и служащие источником питания A. tumefaciens. Какая именно аминокислота синтезируется, зависит от Ti-плазмиды, трансформировавшей клетку: одни бактерии A. tumefaciens несут октопиновые, а другие - нопа-линовые плазмиды. И опухолевая трансформация, и синтез опинов вызваны Т-ДНК. В Т-ДНК содержится несколько генов, контролируемых отдельными промоторами, которые и определяют все свойства опухолевых клеток. Трансформация клеток Т-ДНК стабильно наследуется; некоторые трансформированные культуры существуют без изменения уже более 20 лет. Интегрированная Т-ДНК наследуется по законам Г. Менделя.

Ti-Плазмиды способны трансформировать практически все двудольные растения, что делает их перспективным вектором для введения чужеродных ДНК в растения (рис.13).

Рис.13. Физическая карта неопалиновой Ti- плазмиды. Гены Onc ответствены за онкогенность, ген Noc - за синтез неопалина, ген Arc - за деградацию аргинина

К сожалению, трансформированные Т-ДНК клетки пока не способны давать полноценные растения. Однако были получены мутанты Т-ДНК, трансформирующие растительные клетки и не подавляющие их способности превращаться в растение. Внедрение чужеродных генов в Т-ДНК, под контроль промоторов, способных функционировать в растении, которое может быть осуществлено с помощью специально сконструированных векторов, дает возможность включать их в геном растительных клеток и получать растения, содержащие новую генетическую информацию.

Для улучшения свойств сельскохозяйственных растений необходимо внедрение в них такой генетической информации, которая делала бы их устойчивыми к засухе, заморозкам, позволяла расти на засоленных почвах, придавала способность фиксировать азот и устойчивость к сельскохозяйственным вредителям. Это осуществляют переносом соответствующих генов из растений, обладающих подобными свойствами. Так, в качестве примера можно привести создание петунии (Petunia) или табака (Nicotiana tabacum), устойчивых к гербициду глифосату, путем введения в клетки растений гена, дающего резистентный к этому веществу фермент. Из полученных таким образом клеток вырастали затем целые взрослые растения.

ЛИТЕРАТУРА.

Р. Бирс, Э. Бэсит. Рекомбинантные молекулы: Значение для науки и практики. Москва. Изд-во Мир. 1980.